大孔樹脂純化龍眼核多酚及其組分分析

何 婷,王 凱,趙 雷,胡卓炎

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

龍眼(DimocarpuslonganLour.)又稱桂圓,屬無患子科[1]?，F(xiàn)代研究表明龍眼果肉具有抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[2],而且其種仁龍眼核也具有顯著的醫(yī)療保健作用[3]。龍眼核約占龍眼果重的17%[4],含有大量的多酚、黃酮等活性物質(zhì)[5-6]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降血脂等生理功能[7],被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健營養(yǎng)等眾多領(lǐng)域[8]。而在龍眼加工過程中,每年廢棄的龍眼核多達(dá)十幾萬噸[9],造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。

目前國內(nèi)外對龍眼核的研究主要集中在淀粉[10]、色素[11]、總黃酮[12]及多酚[13]的提取、利用樹脂初步吸附分離純化多酚[14-15]、粗提液的降血糖作用[16-17]。但目前,龍眼核多酚類物質(zhì)的組成成分尚不明確,缺乏系統(tǒng)研究。

本研究以‘儲良’品種的龍眼核為原料,采用乙醇提取其中的多酚類物質(zhì)并用大孔樹脂對其純化,對比四種大孔樹脂的純化效果,并對純化條件進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q-TOP-MS/MS)對龍眼核多酚提取物的主要組成成分進(jìn)行分析和鑒定,旨在為龍眼核多酚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

儲良龍眼 廣東省茂名高州市;大孔樹脂D101、D3520、AB-8、DM21 南開大學(xué)化工廠;95%乙醇 分析純,天津富宇精細(xì)化工有限公司;福林酚、沒食子酸 分析純,上海源葉生物科技有限公司;鹽酸、氫氧化鈉 分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠。

BJ-150型多功能粉碎機(jī) 德清拜杰電器有限公司;AUW120型電子分析天平、Uvmini-1240型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;SHA-CA晶波水浴恒溫振蕩 常州普天儀器制造有限公司;YZ1515型恒流泵 保定齊力恒流泵有限公司;6540UHD-Q-TOF型質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龍眼核多酚的提取 新鮮龍眼采收后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,人工去皮取肉,果核經(jīng)清洗干凈,置于60 ℃烘箱中烘干至恒重,用多功能粉碎機(jī)粉碎成粉末過60目篩備用。準(zhǔn)確稱取龍眼核粉末100 g,加入3 L 95%乙醇后,在70 ℃下用攪拌機(jī)攪拌90 min,提取3次。合并提取液,2150×g離心10 min,50 ℃下減壓濃縮至一定濃度后置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 龍眼核總酚含量的測定 參考Nuchanart等[18]的方法測定龍眼核中多酚含量。濃縮后的樣品溶液用70%乙醇稀釋,取0.1 mL稀釋后的樣品溶液加入0.5 mL福林酚溶液,混勻后于室溫下反應(yīng)3～4 min。在8 min內(nèi)加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液后定容至10 mL。室溫下反應(yīng)2 h后,用分光光度計(jì)在765 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.0586X+0.007,R2=0.9993。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度良好,可以用于測定龍眼核多酚含量。

1.2.3 龍眼核多酚的純化

1.2.3.1 大孔樹脂的吸附量、吸附率及解吸量、解吸率的測定 將大孔樹脂分別于95%乙醇中浸泡24 h,用蒸餾水洗至無醇味,再用體積分?jǐn)?shù)5%的NaOH溶液浸泡12 h,洗滌至中性后浸泡于體積分?jǐn)?shù)5%的HCl中12 h,洗滌至中性后靜置待用[19]。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過預(yù)處理的AB-8、D3520、D101、DM21四種樹脂(濾紙吸干)各5.0 g于錐形瓶中,加入50 mL龍眼核多酚粗提液(多酚質(zhì)量濃度為2.6 mg/mL),置于30 ℃、120 r/min搖床上恒溫振蕩24 h后測上清液中的多酚濃度,分別計(jì)算得到四種大孔樹脂的吸附量和吸附率。將吸附飽和的樹脂加入50 mL、95%乙醇中,在上述條件下解吸24 h后測多酚的含量[20]。

根據(jù)公式(1)～(4)計(jì)算不同樹脂的吸附量、吸附率、解吸量和解吸率。

吸附量(mg/g濕樹脂)=(C0-Ce)×V0/W

式(1)

吸附率(%)=(C0-Ce)/C0×100

式(2)

解吸量(mg/g濕樹脂)=Cd×Vd/W

式(3)

解吸率(%)=Cd/(C0-Ce)×100

式(4)

式中:C0為未吸附初始多酚濃度(mg/mL);Cd為解吸液的多酚濃度(mg/mL);Ce為吸附平衡時多酚濃度(mg/mL);V0為多酚初始加入體積(mL);Vd為解吸液體積(mL);W為濕樹脂質(zhì)量(g)。

1.2.3.2 大孔樹脂的靜態(tài)吸附及解吸動力學(xué) 將大孔樹脂按1.2.3.1所述方法預(yù)處理后,稱取10份5.0 g(濾紙吸干)大孔樹脂,與50 mL的龍眼核多酚粗提液混合,置于搖床上于30 ℃、120 r/min分別振蕩1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h后取1 mL上清液,按式(2)計(jì)算大孔樹脂的吸附率,每個時間點(diǎn)做兩個平行,取平均值繪制靜態(tài)吸附曲線。稱取10份吸附飽和的樹脂加入50 mL、95%的乙醇在同樣的條件于1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h時分別取解吸上清液1 mL,按式(4)計(jì)算大孔樹脂的解吸率,每個時間點(diǎn)做兩個平行,取平均值繪制靜態(tài)解吸曲線[21-22]。

1.2.3.3 乙醇濃度對AB-8大孔樹脂靜態(tài)解吸效果的影響 取按1.2.3.1所述處理的7份吸附飽和的AB-8樹脂,分別置于錐形瓶中,各加入50 mL不同濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%)的乙醇溶液,置于搖床上(30 ℃、120 r/min)振蕩解吸10 h,收集不同乙醇濃度的解吸液,測定多酚的濃度,計(jì)算解吸率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.2.3.4 洗脫液pH對AB-8大孔樹脂靜態(tài)解吸效果的影響 取按1.2.3.1所述處理的6份吸附飽和的AB-8樹脂,分別置于錐形瓶中,各加入50 mL濃度為70%乙醇溶液,用0.1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)至不同pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5),置于搖床上(30 ℃、120 r/min)振蕩解吸10 h,收集不同pH的解吸液,測定多酚的濃度,計(jì)算解吸率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.2.3.5 龍眼核多酚動態(tài)洗脫曲線 將活化后的AB-8樹脂濕法裝入玻璃層析柱(2.5 cm×60 cm)中,待樹脂柱平衡后,加入龍眼核多酚粗提液。用蒸餾水洗脫雜質(zhì),以pH為4、濃度為70%的乙醇進(jìn)行動態(tài)洗脫,分管收集洗脫液(10 mL/管),測定每管洗脫液中的多酚濃度。

1.2.4 LC-MS分析龍眼核多酚的組成成分 參考Li等[23]、Chen等[24]的方法,采用LC-MS對龍眼核多酚的組成成分進(jìn)行測定。色譜條件:安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱,紫外分光光度檢測器,柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,檢測波長280 nm。無機(jī)相為0.4%(v/v)甲酸水溶液,有機(jī)相為乙腈。梯度洗脫:0～20 min(乙腈25%～35%),20～40 min(乙腈35%～55%),40～50 min(乙腈55%),55 min(乙腈25%)。

質(zhì)譜條件:ESI離子源,負(fù)離子模式全掃描檢測,掃描范圍50～1000 m/z,干燥氣為氮?dú)狻?/p>

1.3 數(shù)據(jù)處理

樹脂篩選、吸附解吸動力學(xué)曲線及乙醇濃度和pH對大孔樹脂解吸效果的影響采用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

四種大孔樹脂(AB-8、D3520、D101和DM21)的靜態(tài)吸附量、吸附率、解吸量和解吸率如表1所示。從表中可以得出,AB-8和D101的吸附量(13.40、13.18 mg)和吸附率(51.36%、50.49%)均顯著(p<0.05)高于D3520和DM21的吸附量(11.63、11.36 mg)和吸附率(44.57%、43.54%),說明AB-8和D101對龍眼核多酚的吸附效果較好。AB-8和D101的解吸量(12.92、12.82 mg)顯著(p<0.05)高于D3520(11.59 mg)和DM21(10.98 mg),但二者的解吸率處于D3520(99.36%)和DM21(96.59%)之間。綜合考慮吸附率、解吸率、解吸率、解吸量,認(rèn)為AB-8和D101的靜態(tài)吸附和解吸效果較好,因此選擇AB-8和D101樹脂作進(jìn)一步研究。

表1 4種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能

2.2 大孔樹脂AB-8和D101的靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)曲線

從圖1a可以得出,兩種樹脂都能在短時間內(nèi)吸附較多的龍眼核多酚。隨著吸附時間的延長,吸附速率逐漸上升,但升高程度逐漸變慢,AB-8和D101分別在5和6 h后趨于吸附平衡。兩種樹脂對龍眼核多酚的吸附能力略有差異,AB-8樹脂較D101樹脂的吸附率更高。從圖1b可以得出隨著解吸時間的延長,兩種樹脂的解吸率逐漸上升,解吸10 h后基本達(dá)到平衡,AB-8的解吸率略高于D101。因此,AB-8樹脂在龍眼核多酚吸附和解吸特性上優(yōu)于D101樹脂,故選擇AB-8樹脂對其純化龍眼核多酚的條件進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 靜態(tài)吸附(a)與解吸(b)動力學(xué)曲線

2.3 乙醇濃度對AB-8樹脂解吸效果的影響

多酚類物質(zhì)一般具有一定的極性和親水性,所以具有一定的極性的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等極性溶液對多酚的解吸具有良好的效果[25-26],但是考慮到安全無毒性和廉價(jià)易得,選擇乙醇作為洗脫劑。不同濃度的乙醇對AB-8樹脂靜態(tài)解吸效果如圖2所示。隨著乙醇濃度的增加,解吸率先升高后下降,當(dāng)乙醇濃度為70%時,解吸率最高達(dá)到99.03%。根據(jù)“相似相溶”原理,龍眼核乙醇提取物中多酚極性較大,低濃度的乙醇不能破壞樹脂與多酚形成的氫鍵,故解吸率較低。而高濃度乙醇會使極性與多酚極性相差變大[27],解吸率亦會降低。因此,選擇濃度為70%乙醇作為龍眼核多酚的洗脫劑。

圖2 乙醇濃度對AB-8樹脂解吸率的影響

2.4 解吸液pH對AB-8樹脂解吸效果的影響

由圖3可知,當(dāng)解吸液的pH由2升高至4時,AB-8樹脂的解吸率由91.36%逐漸升高至99.82%。而當(dāng)解吸液的pH進(jìn)一步升高至4.5時,AB-8樹脂的解吸率顯著降低至96.10%。說明解吸液pH為4時最適合大孔樹脂AB-8解吸龍眼核多酚。這是因?yàn)閺凝堁酆酥刑崛〕龅亩喾游镔|(zhì)含有較多酚羥基結(jié)構(gòu),呈弱酸性,不穩(wěn)定[21]。在弱酸性條件下能保持分子狀態(tài)從大孔樹脂上解吸,當(dāng)pH過低,多酚在水中溶解度降低,不利于解吸;而pH過高時,不利于保持酚羥基結(jié)構(gòu)。

圖3 解吸液pH對AB-8樹脂解吸率的影響

2.5 洗脫液體積對龍眼核多酚洗脫效果的影響

龍眼核多酚動態(tài)洗脫曲線如圖4,當(dāng)洗脫液體積為50 mL時,龍眼核多酚有少量被洗脫出來。隨后龍眼核多酚隨著洗脫液的增加而急速被洗脫出來且在90 mL時濃度達(dá)到最大值6.48 mg/mL。在250 mL時基本將龍眼核多酚洗脫出來。因此考慮洗脫效率,用250 mL的洗脫液進(jìn)行洗脫。從圖4中看出動態(tài)條件下AB-8樹脂上吸附的龍眼核多酚易被洗脫下來,龍眼核多酚洗脫峰比較集中,峰型基本對稱。

圖4 洗脫液體積對龍眼核多酚洗脫效果的影響

2.6 龍眼核多酚的組成分析

龍眼核多酚在負(fù)離子模式下的總離子流圖如圖5所示。從圖中可以看出,龍眼核提取物中多酚類物質(zhì)能夠得到較好的分離,得到13個響應(yīng)較好的色譜峰。對各成分進(jìn)行一、二級質(zhì)譜分析,結(jié)果見圖6。將龍眼核多酚主要成分的保留時間,一、二級質(zhì)譜分子離子峰和相對分子質(zhì)量歸納總結(jié)于表2。結(jié)合數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析,推測各成分的化學(xué)名稱見表2和分子結(jié)構(gòu)見圖6。

表2 龍眼核多酚化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖5 負(fù)離子模式下龍眼核乙醇提取物的總離子流圖

圖6 龍眼核多酚的二級質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)圖

峰1產(chǎn)生m/z 483.0786的分子離子峰,即[M-H]-為483.0786,分子量為484。在MS2中產(chǎn)生碎片m/z 169.0147,如圖6a所示為沒食子酸的分子離子峰,結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析確定峰成分1為1,2′-雙-O-沒食子酰-D-呋喃金縷梅糖(1,2′-Di-O-galloylhamamelofuranose)。峰2給出準(zhǔn)分子離子m/z為633.0738[M-H]-,碎片離子m/z 463.0521為[M-沒食子酸]-,m/z 300.9994和m/z 169.0139分別為鞣花酸和沒食子酸的分子離子峰,子離子碎片(圖6b)與文獻(xiàn)[28-29]報(bào)道一致,確定峰成分2為柯里拉京(Corilagin)。峰3的m/z為289.0720[M-H]-,在MS2中產(chǎn)生的碎片離子m/z 247.0250,如圖6c所示,是準(zhǔn)分子離子[M-H]-失去一個中性碎片CO2得到,結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析確定峰成分3為6-Hydroxy-alpha-pyrufuran。峰4的m/z為469.0029[M-H]-,m/z 425.0157為[M-H-CO2]-,m/z 299.9911[M-H]-是準(zhǔn)分子離子[M-H]-失去一分子沒食子酸所得,二級碎片離子(圖6d)與文獻(xiàn)[30]報(bào)道一致,故判斷峰成分4為地榆酸內(nèi)酯(Sanguisorbic acid dilactone)。峰5產(chǎn)生 m/z為953.0904[M-H]-的分子離子峰(圖6e),與文獻(xiàn)[30-34]報(bào)道的二級離子碎片一致,確定峰成分5為訶子鞣質(zhì)(Chebulagic acid)。峰6給出準(zhǔn)分子離子m/z為197.0454[M-H]-(圖6f),是沒食子酸的衍生物[35],結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析峰成分6為3,4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸(3,4-O-Dimethylgallic acid)。峰7產(chǎn)生m/z為461.1682[M-H]-的分子離子峰,在MS2中產(chǎn)生的碎片m/z 300.9992(圖6g)為鞣花酸的分子離子峰,含有鞣花酸?；?結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析確定峰成分7為Verbasoside。峰8給出準(zhǔn)分子離子m/z為247.0250[M-H]-(圖6h),結(jié)合數(shù)據(jù)庫資源確定峰成分8為7-Deshydroxypyrogallin-4-Carboxylic Acid。峰10產(chǎn)生m/z為465.1557[M-H]-的分子離子峰,m/z 301.0005和m/z 169.0146分別為鞣花酸和沒食子酸的分子離子峰,因此確定峰成分10為Polystachin(黃酮)。峰11是一種木質(zhì)素類的成分,推測為2,2′-二羥基-3,3′-二甲氧基-5,5′-二羧基聯(lián)苯(DDVA)(2,2′,3-Trihydroxy-3′-methoxy-5,5′-dicarboxybiphenyl)。峰9和峰12均給出準(zhǔn)分子離子m/z為433.0432[M-H]-,且均有相應(yīng)的二級碎片離子m/z 301和m/z 172。推測二者可能為同分異構(gòu)體,由于m/z 301為鞣花酸分子離子峰,峰9和12可能為鞣花酸衍生物,但它們的確切的分子結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步研究。峰13荷質(zhì)比m/z為300.9994[M-H]-,m/z 283.9966為[M-H-H2O]-的碎片離子(圖6k),m/z 229.0147是[M-H-H2O-2CO]-產(chǎn)生的碎片離子,m/z 145.0300是[M-H-H2O-2CO]-進(jìn)一步丟失3分子CO所產(chǎn)生的碎片離子,與文獻(xiàn)[36]的離子碎片進(jìn)行對比,確定峰成分13為鞣花酸(Ellagic acid)。

3 結(jié)論

AB-8是純化龍眼核多酚的理想樹脂,靜態(tài)吸附率解吸率分別為51.36%、96.4%,且能在5 h內(nèi)達(dá)到吸附與解吸的平衡。當(dāng)乙醇濃度為70%、pH為4時,AB-8樹脂的靜態(tài)解吸效果最好,解吸率達(dá)到99.03%。采用HPLC-Q-TOP-MS/MS對龍眼核多酚的主要成分進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明龍眼核提取物中含柯里拉京(Corilagin)、訶子鞣質(zhì)(Chebulagic acid)、鞣花酸(Ellagic acid)等13種主要化學(xué)成分,其中6-Hydroxy-alpha-pyrufuran、地榆酸內(nèi)酯(Sanguisorbic acid dilactone)等8種化合物在龍眼核多酚中龍眼核多酚中未見報(bào)道。研究結(jié)果將為龍眼核的綜合利用提供新的思路,對提高龍眼加工的經(jīng)濟(jì)和社會效益以及龍眼產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展有促進(jìn)作用。