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    高通量基因測序技術(shù)在胎兒性染色體非整倍體檢測中的應(yīng)用

    2019-08-28 02:51:14蔡海英許華英熊卿圓
    中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用 2019年15期
    關(guān)鍵詞:整倍體文庫核型

    蔡海英 許華英 熊卿圓

    染色體非整倍體異常是最為嚴(yán)重的出生缺陷之一, 最為常見的為13三體綜合征、18三體綜合征、21三體綜合征以及性染色體異常, 以上為智力障礙以及生理缺陷的重要指征,目前尚無任何有效治療方法[1]。當(dāng)下, 主要通過產(chǎn)前篩查來檢查高危人群, 為此無創(chuàng)產(chǎn)前篩查應(yīng)運(yùn)而生, 而NIPT-plus對13三體綜合征、18三體綜合征、21三體綜合征的檢查中具有高通量、錯誤率低的優(yōu)勢, 已經(jīng)被臨床上廣泛應(yīng)用。然而,該技術(shù)在性染色體異常中的研究非常少, 對于其可行性作者將進(jìn)行研究, 為在日后工作中積累經(jīng)驗(yàn), 現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選擇2018年7月~2019年1月到佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院門診產(chǎn)檢的200例單活胎孕婦作為研究對象,經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批同意, 簽署知情同意書。

    1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 所有參加 NIPT-plus篩查的夫妻雙方不是染色體非整倍體疾病患者、染色體多態(tài)表現(xiàn)且近期未接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、免疫治療等。

    1.3 方法

    1.3.1 樣本的采集、保存、運(yùn)輸 采集孕婦7~10 ml外周血(采血手法與一般采血無異), Ardent抗凝管采集完畢后輕微顛倒采血管10次, 常溫15~30℃暫存, 72 h內(nèi)送達(dá)并及時分離血漿。血漿樣本應(yīng)在干冰條件下運(yùn)輸, 到達(dá)后及時存放于-80℃冰箱中。

    1.3.2 游離DNA提取 使用磁珠法在200~600 μl血漿提取游離 DNA。游離DNA提取是將游離DNA從血漿細(xì)胞中裂解,分離, 純化提取的過程。并建立標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制體系。保證游離DNA的質(zhì)量達(dá)到下步實(shí)驗(yàn)要求, 保證其片段多態(tài)性有足夠的代表性。

    1.3.3 文庫制備 文庫的制備是將提取好的DNA進(jìn)行末端修復(fù)、補(bǔ)平, 加測序接頭、擴(kuò)增及純化的過程, 其目的是為之后的測序制作好合格的文庫DNA。對于同一個run的不同文庫可使用特異性接頭(barcode)進(jìn)行區(qū)分。同一個run里面不能出現(xiàn)2個相同的barcode。文庫的構(gòu)建嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行, 建庫后的DNA濃度應(yīng)>0.2 ng/ml, 且片段長度達(dá)到目標(biāo)片段長度范圍[胎兒游離DNA(cffDNA)一般在150~200 bp][2]。

    1.3.4 測序及數(shù)據(jù)分析 DNA測序是指經(jīng)過一系列檢測分析特定DNA片段的堿基序列的過程。DNA數(shù)據(jù)分析是指將測序儀生成的原始的read比對到一個參考序列對比, 并將對比上的read進(jìn)行可視化及得出相關(guān)生物學(xué)意義的過程。研究表明, 胎兒基因組符合正態(tài)分布規(guī)律。在基因分析領(lǐng)域,常用正態(tài)分布的理論來推斷差異發(fā)生率, 從而判斷個體是否存在顯著的差異。臨床試驗(yàn)中采用大數(shù)據(jù)做成正態(tài)分布圖,判斷標(biāo)準(zhǔn)為Z值。在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測中,Z值介于-3~3, 一般判斷為陰性, 反正為陽性[3-6]。

    1.3.5 陰陽性質(zhì)控 為了更好的保證檢測的準(zhǔn)確性, 防止因機(jī)器故障等導(dǎo)致檢測樣品出現(xiàn)假陰性和假陽性的發(fā)生, 在每次檢測中應(yīng)該加入至少一對的陰陽性質(zhì)控, 用于監(jiān)控測序結(jié)果是否真實(shí)有效[7,8]。陰陽性質(zhì)控品應(yīng)是已確定知道其準(zhǔn)確結(jié)果的DNA片段。所需濃度及測序方法與一般樣品無異。

    1.3.6 羊水染色體核型分析 對無創(chuàng)產(chǎn)前基因測序提示性染色體非整倍體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)孕婦, 經(jīng)產(chǎn)前遺傳咨詢、知情同意后, 在手術(shù)室, 無菌操作下, 超聲引導(dǎo)定位, 經(jīng)腹羊膜腔穿刺抽取羊水 20 ml, 送遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)、得到分裂中期的細(xì)胞, 再經(jīng)過氯化鉀溶液低滲、固定液固定、滴片制成玻片、胰酶消化、吉姆薩染色一系列實(shí)驗(yàn)操作, 在油鏡下觀察分裂相的染色體形態(tài), 根據(jù)國際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名體系(ISCN2013)進(jìn)行核型分析及計(jì)數(shù)[4,9]。

    2 結(jié)果

    2.1 NIPT-plus與羊水細(xì)胞核型結(jié)果分析 200例樣本中,NIPT-plus提示3例性染色體非整倍體存在異常, 其中1例(45,X), 1例(47, XXX), 1例(47, XXY)。經(jīng)羊水細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型, 其中2例與NIPT-plus結(jié)果一致, 而1例羊水染色體核型分析結(jié)果為正常核型。見表1。

    表1 NIPT-plus與羊水細(xì)胞核型結(jié)果

    2.2 NIPT-plus準(zhǔn)確性分析 200例樣本中NIPT-plus篩查出3例染色體非整倍體異常, 檢出率為1.5%(3/200);經(jīng)羊水染色體核型確診2例染色體非整倍體異常, 染色體非整倍體異常發(fā)生率為1.0%(2/200), NIPT-plus篩查的陽性預(yù)測值為66.67%(2/3)。

    3 討論

    高齡產(chǎn)婦的卵子老化, 導(dǎo)致在減數(shù)分裂時存在染色體不分離的情況增高, 影響增加胎兒染色體異常, 性染色體異常與孕婦的年齡具有相關(guān)性[10]。NIPT-plus對染色體非整倍體異常檢測的陽性預(yù)測值高達(dá)66.67%, 此外1例假陽性結(jié)果的出現(xiàn)與母體因素、性染色體互換以及胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞有一定的關(guān)聯(lián)。結(jié)果較參考文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)存在差距, 這與個體化差異等多方面因素有一定的關(guān)系, 仍需在增加研究樣本的同時,深入研究為臨床提供更加科學(xué)的依據(jù)。

    綜上所述, NIPT-plus技術(shù)應(yīng)用于胎兒性染色體非整倍體檢測中具有一定的可行性, 可以作為臨床輔助檢查的手段之一。

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