銅綠假單胞菌新西蘭兔膿胸模型的建立

張真強(qiáng) 李金壟 韋球 廖金玲 覃雅婷 鄧?guó)櫭?梁斌 張士卿 孔晉亮 王可

病菌侵入胸膜腔，產(chǎn)生膿性滲出液積聚于胸膜腔內(nèi)的化膿性感染，稱為膿胸。膿胸患者的胸腔引流液為膿性液體。有報(bào)道稱膿胸的發(fā)生多由肺部感染蔓延至胸膜腔所致。除此之外，胸腔穿刺置管引流也是膿胸形成的一部分原因[1]。銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染的常見(jiàn)原因，包括燒傷傷口感染、尿路感染、菌血癥及醫(yī)院獲得性肺炎[2]。銅綠假單胞菌是常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌，它擁有廣泛的代謝多樣性，這讓它能夠在許多環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件下繁殖，也使得它能成為一種機(jī)會(huì)致病菌[3]。膿胸可因各種病原體感染累及胸膜腔而形成。常見(jiàn)的病原體有鏈球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌；也有銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌；還可有厭氧菌及兼性厭氧菌，甚至是多種微生物的混合感染[1]。本研究通過(guò)銅綠假單胞菌建立新西蘭兔膿胸模型，為進(jìn)一步研究銅綠假單胞菌在胸腔環(huán)境中的生長(zhǎng)特性、耐藥機(jī)制及相應(yīng)的治療策略提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性新西蘭兔24 只，體重（2.5±0.5）kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件：室溫，空氣流通，動(dòng)物自由攝食飲水，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組16 只，對(duì)照組 8 只。

1.1.2 菌株 本實(shí)驗(yàn)所用銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1 由新加坡南洋理工大學(xué)生命科學(xué)研究院惠贈(zèng)。1.1.3 主要試劑及儀器 LB 瓊脂粉、LB 肉湯（北京陸橋公司），戊巴比妥鈉（SIGMA），HE 染色試劑盒（索萊寶），一次性輸液用頭皮針管（湖南康利萊醫(yī)療器械有限公司），超凈臺(tái)（蘇州凈化），生物安全柜（蘇凈安泰BHC-1300IIA2），分光光度計(jì)（普析通用T6），生化培養(yǎng)箱（恒宇SPX-300-II），冷凍離心機(jī)（HERMLE Z326K），超低溫冰箱（Thermo 995），多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher3020），漩渦振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備 本研究使用的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1/實(shí)驗(yàn)菌株儲(chǔ)存于含15%甘油的LB肉湯培養(yǎng)基-80℃，接種至LB 瓊脂培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)18～24h，然后挑取單個(gè)菌落接種于LB 肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜（14～16h），離心，4℃，3 000rpm，15min，沉淀物使用PBS 緩沖溶液洗滌2 次，用LB 肉湯稀釋至OD600=0.1（菌量為107～108CFU/ml），稀釋成105～106CFU/ml 的細(xì)菌懸浮液備用，使用菌落計(jì)數(shù)法驗(yàn)證菌液濃度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及新西蘭兔膿胸模型的建立 于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室，將24 只新西蘭兔隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組8 只，實(shí)驗(yàn)組16 只。均通過(guò)耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉新西蘭兔，固定，右側(cè)胸壁第6 肋間定位，消毒，無(wú)菌條件下進(jìn)行穿刺，置入剪除針頭的6 號(hào)滅菌一次性輸液針管，實(shí)驗(yàn)組注入新西蘭兔2ml/kg 的105～106CFU/ml 上述菌液，對(duì)照組注入2ml/kg LB 肉湯培養(yǎng)液，各組均用1ml 無(wú)菌生理鹽水沖洗管壁，以將管壁內(nèi)浮游菌排入胸腔。將輸液針管剪除頭端置入胸腔內(nèi)作為載體（導(dǎo)管長(zhǎng)度13cm），縫合穿刺部位皮膚。

1.2.3 新西蘭兔膿胸模型胸膜組織病理檢查 取新西蘭兔右側(cè)胸腔壁層胸膜組織（胸壁及膈面胸膜）、臟層胸膜組織（肺組織），于10%甲醛溶液中固定24h，制作常規(guī)石蠟切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胸膜厚度及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.4 新西蘭兔胸腔積液/膿絮狀物革蘭染色 解剖時(shí)，無(wú)菌操作下打開新西蘭兔胸腔，取胸腔積液/膿絮狀物保存于滅菌離心管中，無(wú)菌操作下取少量胸腔積液/膿絮狀物涂布于載玻片，過(guò)火固定。將玻片進(jìn)行革蘭染色，油鏡下觀察。

1.2.5 新西蘭兔膿胸模型胸腔留置管的細(xì)菌培養(yǎng) 經(jīng)消毒鋪巾，使用滅菌器械剪開新西蘭兔右側(cè)胸壁，取出胸腔內(nèi)留置導(dǎo)管，每個(gè)樣本取管3cm 剪碎，收集至無(wú)菌試管中，PBS 緩沖溶液沖洗3 次，使用漩渦震蕩儀震蕩10min。取導(dǎo)管浸出液稀釋涂盤，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果記作CFU/ml。

2 結(jié)果

2.1 膿胸模型評(píng)估 共有22 只新西蘭兔存活并完成實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組無(wú)死亡，實(shí)驗(yàn)組意外死亡2 只。術(shù)后第4 天解剖新西蘭兔，實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔胸腔中可見(jiàn)不等量的胸腔積液或膿絮狀物，胸膜表面粗糙；對(duì)照組胸腔內(nèi)無(wú)明顯胸腔積液及膿絮狀物及粘連，胸膜表面光滑，見(jiàn)圖1。膿胸模型成功標(biāo)準(zhǔn)：新西蘭兔胸腔中可見(jiàn)胸膜產(chǎn)生粘連，胸腔中形成膿液或膿絮狀物，胸膜病理學(xué)檢查可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，胸腔積液/膿絮狀物革蘭染色可見(jiàn)革蘭陰性桿菌，即證明膿胸模型建立成功。

圖1 新西蘭兔胸腔大體觀

2.2 胸膜組織的病理檢查 相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔胸膜明顯增厚，胸膜中白細(xì)胞滲出增多，見(jiàn)圖2。

圖2 新西蘭兔壁層胸膜組織HE 染色

2.3 胸腔積液/膿絮狀物的革蘭染色 對(duì)照組胸腔內(nèi)無(wú)明顯胸腔積液或膿絮狀物形成，實(shí)驗(yàn)組胸腔積液/膿絮狀物涂片革蘭染色，鏡下可見(jiàn)革蘭陰性桿菌分布，見(jiàn)圖3。

圖3 實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔胸腔積液/膿絮狀物革蘭染色

2.4 胸腔留置導(dǎo)管的菌落計(jì)數(shù) 對(duì)照組新西蘭兔胸腔留置導(dǎo)管未培養(yǎng)出細(xì)菌；實(shí)驗(yàn)組胸腔留置導(dǎo)管培養(yǎng)出銅綠假單胞菌菌落，菌量為（6.020±0.438）log（CFU/ml）。

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膿胸模型在近年的一些研究中偶有提及，包括金黃色葡萄球菌膿胸模型、肺炎鏈球菌膿胸模型等。早期學(xué)者實(shí)驗(yàn)證明了直接向動(dòng)物胸腔中注入細(xì)菌并不能成功建立模型，結(jié)果是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死于敗血癥或者胸腔內(nèi)的細(xì)菌被完全清除[4]。近年來(lái)，大多研究者選擇向胸腔內(nèi)注入松節(jié)油誘發(fā)無(wú)菌性胸膜炎，產(chǎn)生滲出液以為細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)等生長(zhǎng)條件，再向胸腔中注入細(xì)菌以誘導(dǎo)膿胸的發(fā)生[5]。亦有研究成功使用腦心浸液培養(yǎng)的肺炎鏈球菌注入大鼠胸腔以建立膿胸模型[6]。與其他研究不同的是，本研究一方面在未使用松節(jié)油刺激胸膜的前提下使用LB肉湯作為銅綠假單胞菌懸液的溶劑，將細(xì)菌注入胸腔，并留置導(dǎo)管，成功制造了新西蘭兔的銅綠假單胞菌膿胸模型；另一方面，對(duì)留置于胸腔中的導(dǎo)管進(jìn)行分析，這是其他動(dòng)物膿胸模型研究中所未提及的。同時(shí)使用LB 肉湯單獨(dú)注入新西蘭兔胸腔作為對(duì)照組，最終發(fā)現(xiàn)對(duì)照組新西蘭兔膿胸中LB 肉湯被完全吸收，胸腔內(nèi)無(wú)明顯粘連，且無(wú)膿絮狀物及胸腔積液產(chǎn)生，證明膿胸的發(fā)生的確是由銅綠假單胞菌在胸腔內(nèi)感染形成。

在臨床中，胸腔閉式引流是常用的膿胸治療手段之一[7，8]，胸腔引流有利于排出胸腔內(nèi)膿液，以減少肺組織所受積液壓迫，促進(jìn)肺復(fù)張及功能的恢復(fù)。同時(shí)，對(duì)于胸腔內(nèi)存在粘連及分隔的患者，通過(guò)引流管向胸腔內(nèi)注入纖維蛋白溶解藥物也是常用的治療方法。然而，閉式引流的引流管上是否會(huì)有細(xì)菌粘附及生長(zhǎng)，也是個(gè)不容忽視的問(wèn)題。引流管的留置是否會(huì)加重細(xì)菌在胸腔內(nèi)的感染，導(dǎo)致膿胸遷延不愈，值得思考。首先，引流管是否對(duì)胸膜造成異物刺激，進(jìn)而加重胸膜的炎性滲出，為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)條件；其次，引流管的表面可能更適宜細(xì)菌聚集及粘附生長(zhǎng)，而為細(xì)菌提供了生長(zhǎng)環(huán)境及庇護(hù)所。本研究發(fā)現(xiàn)，埋入胸腔內(nèi)的引流管，經(jīng)過(guò)沖洗后，震蕩所得的懸浮液中可培養(yǎng)出大量銅綠假單胞菌，證明了引流管上也有細(xì)菌粘附生長(zhǎng)。生長(zhǎng)在引流管上的細(xì)菌是否持續(xù)向胸腔中釋放，而導(dǎo)致膿胸遷延不愈，仍有待研究。

本課題組將在后續(xù)的研究中繼續(xù)改進(jìn)膿胸模型，并使用該模型研究膿胸發(fā)生的影響因素，如胸腔中pH 值，菌株種類及進(jìn)一步的藥物干預(yù)試驗(yàn)。

總之，本研究通過(guò)胸腔穿刺置管向新西蘭兔胸腔中注入銅綠假單胞菌，且置入引流管，建立了新的銅綠假單胞菌新西蘭兔膿胸模型，并發(fā)現(xiàn)了引流管上有大量細(xì)菌生長(zhǎng)。使用該膿胸模型，可進(jìn)一步研究銅綠假單胞菌膿胸的發(fā)生機(jī)制及影響膿胸形成的理化因素，為進(jìn)一步研究膿胸的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。