線粒體轉(zhuǎn)運RNA基因突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)研究

孫艷梅，張玉霄，盧才義，李泱*

(1解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心心血管內(nèi)科，北京 100853；2赤峰松山醫(yī)院心血管內(nèi)科，赤峰 024000)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension,EH)受多種環(huán)境因素和遺傳因素的共同影響，其中遺傳因素占30%～60%。然而，全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)表明核基因突變不能很好地解釋EH的發(fā)病機制。諸多研究者顯示，心血管疾病與具有母系遺傳模式的線粒體基因(mitochondrial DNA,mtDNA)突變密切相關(guān)，而EH患者表現(xiàn)為典型的母系遺傳特點[1,2]，因此認為EH可能與mtDNA突變有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)與高血壓發(fā)病相關(guān)的線粒體轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA,tRNA)對應的基因突變分別為線粒體tRNAIle、tRNAMet、tRNAGln和tRNAMet/tRNAGln突變等，提示線粒體tRNA的基因突變可能在EH發(fā)病過程中起著重要的作用[3-6]。突變對tRNA轉(zhuǎn)錄修飾及其蛋白翻譯等功能(如tRNA代謝水平、蛋白質(zhì)翻譯水平、呼吸鏈功能及氧耗率等)產(chǎn)生影響，從而影響線粒體功能，進一步改變血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的功能，導致細胞的增殖與凋亡失調(diào)，血管重構(gòu)，收縮功能異常，引起血壓的改變。盡管有較多研究已表明mtDNA突變可引起血壓的改變[7-11]，但這些研究的患者多來自散在家系。本研究依照EH的發(fā)病特點，結(jié)合母系遺傳特征，對多個家系的EH患者采用全mtDNA測序的模式，探討線粒體tRNA的基因突變與EH特別是具有母系遺傳特征的EH間關(guān)系，以期為臨床及早診斷并預防EH提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2018年12月解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的EH患者82例，根據(jù)母系遺傳判別標準，分為母系遺傳EH組(A組，n=17)和非母系遺傳EH組(B組，n=65)。另選取同期來本院進行健康體檢的健康人群作為對照組(C組，n=33)。受試者均為漢族。EH判斷標準：既往明確診斷為EH，目前服藥治療血壓維持正?；颉?40/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；或者既往無高血壓病史，門診不同日隨訪2次平均收縮壓≥140 mmHg或平均舒張壓≥90 mmHg(間隔24 h)。母系遺傳EH判別標準：參考以往研究者母系遺傳高血壓家系的標準，2代母系成員中都有EH患者，且至少有一代有2例以上(含2例)同代母系成員明確診斷為EH[12]。為了減少非母系遺傳EH對實驗的影響，還增加2個條件，一為三代母系成員均有EH患者；二為非母系成員EH者不能超過1例。非母系遺傳判別標準：除本人為EH患者外，三代母系成員內(nèi)無任何1名明確診斷為EH。健康對照組標準：包括本人在內(nèi)的三代所有家系成員中均無EH。排除標準：(1)繼發(fā)于腎臟病、內(nèi)分泌疾病、血管病變、顱腦病變及其他疾病的繼發(fā)性高血壓；(2)伴有嚴重的心力衰竭、心肌病、風心病、先天性心臟病；(3)明確診斷為其他線粒體病，如線粒體腦病乳酸性酸中毒伴卒中樣發(fā)作、母系遺傳性心肌病、Leber′s眼病、肌陣攣癲癇伴肌肉破碎紅纖維綜合征、慢性進行性眼外肌麻痹、帕金森病、老年癡呆癥、母系遺傳性耳聾、氨基糖苷誘發(fā)的耳聾等；(4)惡性腫瘤或血液系統(tǒng)疾病(如嚴重貧血、再生障礙性貧血及淋巴瘤等)；(5)正在服用避孕藥或已經(jīng)妊娠或半年內(nèi)準備妊娠的婦女；(6)有肝炎、HIV陽性、梅毒等傳染??；(7)主管臨床醫(yī)師認為不適合參與該研究。本研究通過解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準同意實施，所有志愿者均簽署知情同意書。A及B組患者在確定符合納入排除標準后預約時間抽血，對照組在體檢時按照血生化和血常規(guī)檢測取樣的要求抽血。每位志愿者外周靜脈抽血5 ml用以后期檢測分析。

1.2 方法

1.2.1 全血樣本DNA提取及檢測 取新鮮抗凝外周靜脈血3 ml，加到預先裝入9 ml紅細胞裂解液的15 ml離心管中，3 000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，吸棄上清，加1 ml蛋白沉淀液振蕩25 s混勻。3 000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，取上清約3 ml置入另一只干凈的15 ml離心管中，加入等體積異丙醇輕柔顛倒，出現(xiàn)棉絮狀或絲狀白色DNA沉淀。自然沉淀白色DNA后棄大部分上清，然后加入3 ml 70%乙醇，顛倒10次，3 000轉(zhuǎn)/min，離心1 min, 棄上清，空氣晾干沉淀5～10 min，加入DNA溶解液250 μl溶解DNA。采用超微量蛋白核酸分析儀(上海譜元儀器公司)檢測DNA濃度(合格標準A260 nm/A280 nm>1.6)，并行電泳檢測。

1.2.2 全mtDNA擴增及測序分析 在GenBank 中查詢?nèi)巳玬tDNA序列，采用32對交叉重疊引物進行擴增。PCR擴增全長線粒體16.6 kb，DNA片段長度306～805 bp，平均594 bp，擴增的基因多于實際mtDNA長度約14.4%。純化PCR產(chǎn)物，在自動測序儀上進行DNA測序，并用Mac VectorTM 7.0(Oxford Molecular Ltd, Oxford, England)軟件對DNA測序，結(jié)果與線粒體基因文庫MitoMap的修正劍橋序列進行比對分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。多組間比較(均為滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù))應用方差分析。采用雙向無序卡方檢驗及Scheffe多重比較法對線粒體tRNA基因突變率差異進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組受試者基線資料比較

3組受試者性別比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05；表1)。

2.2 母系遺傳EH占EH人群的比例

納入人群中共有82例患者明確診斷為EH，其中母系遺傳EH 17例，占20.7%，低于Yang等[12]報道的由線粒體效應引起的EH比例(35.2%)。

2.3 3組受試者線粒體tRNA基因總突變率比較

線粒體tRNA基因的堿基總數(shù)為1 504個，則A、B、C 3組受試者線粒體tRNA基因堿基總數(shù)分別為25 568、97 760和49 632個。對各組線粒體tRNA的基因突變分析顯示，3組相應的總變異率依次為0.28%(74/25 568)、0.12%(126/97 760)及0.05%(24/49 632)。采用Scheffe多重比較法分析發(fā)現(xiàn)，A組(P=0.024)與B組(P=0.046)tRNA基因總變異率均明顯高于C組，提示EH的發(fā)生確實與線粒體tRNA基因突變密切相關(guān)，但A與B組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.076)，考慮這可能與樣本量小有關(guān)。

2.4 EH家系線粒體tRNA基因變異分析

為了明確母系遺傳EH與mtDNA突變的關(guān)系，對A組的17個家系(A01～A17)線粒體tRNA基因突變分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有1個線粒體tRNA基因位點突變的先證者有A06、A11和A13，其所在3個家系發(fā)生的突變依次為mtDNA A5823G、mtDNA T4386C與mtDNA C15910T。即mtDNA5823位于線粒體tRNACys基因相應位點的堿基A突變?yōu)镚，mtDNA 4386位點tRNAGln基因?qū)獕A基T突變?yōu)镃，mtDNA 15910位點tRNAThr基因?qū)獕A基C突變?yōu)門(表2)。A06號家系所調(diào)查的母系成員共13名，其中7例成員診斷為EH，占比53.8%(7/13)。A11號家系的母系成員8名，7例診斷為EH患者，占比87.5%(7/8)；A13號家系的母系成員12名，9例為EH患者，占比75.0%(9/12)，表明這3個家系中EH的發(fā)生具有典型的母系遺傳特征，提示這3個位點的突變可能與EH發(fā)生密切關(guān)聯(lián)。測序峰值曲線表明，以上突變在外周靜脈血白細胞中均表現(xiàn)為單純均質(zhì)性突變體(圖1)。

分析A組線粒體tRNA基因變異還發(fā)現(xiàn)，mtDNA 5597缺失在4個無任何血緣關(guān)系的家系中均出現(xiàn)。采用對比抽樣人群線粒體tRNA基因堿基測序的方式，發(fā)現(xiàn)115位受試者中19名出現(xiàn)上述相同突變，其中A組4例(23.5%)，B組14例(21.5%)，C組1例(3.0%)。采用Scheffe多重比較法分析發(fā)現(xiàn)，A組與B組的mtDNA 5597缺失率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.127)，A組與C組的發(fā)生率(P=0.002)和B組與C組的發(fā)生率(P=0.002)差異明顯。提示mtDNA 5597缺失與EH的發(fā)生可能有關(guān)，但與母系遺傳EH的發(fā)生無必然聯(lián)系。對A01號的家系線粒體tRNA基因變異發(fā)現(xiàn)，A01號先證者有mtDNA 5597缺失，但其子雖診斷為EH卻未發(fā)現(xiàn)mtDNA 5597的缺失，這也間接表明此位點突變與母系遺傳EH無必然聯(lián)系。

表1 3組受試者基線資料比較

A: matrilinear inheritance essential hypertension group; B: non-matrilinear inheritance essential hypertension group; C:control group. FBG: fasting blood glucose; LDL-C: low density lipoprotein cholesterol; TC: total cholesterol; TG: triglycerides.

表2 母系遺傳EH家系的線粒體tRNA基因突變情況

·represents gene deletion.

圖1 A06、A11及A13號家系先證者mtDNA序列分析(箭頭示突變位點)

3 討 論

目前全球高血壓患病人數(shù)超過11.3億人，其中EH占高血壓人群的90%～95%，是世界上危害人類健康與生活質(zhì)量的最重要疾病之一[13,14]。EH的發(fā)生發(fā)展受遺傳因素和環(huán)境等多種因素的影響，雖然被研究多年，但發(fā)病機制仍不十分清楚[15-17]。既往EH遺傳學的研究主要集中在核基因方面，但GWAS發(fā)現(xiàn)，核基因變異并未能成功揭示EH的發(fā)病原因[18]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，EH特別是具有母系遺傳性質(zhì)的EH發(fā)生與線粒體DNA突變有著較為密切的聯(lián)系[6,19,20]。眾所周知，線粒體是半自主細胞器，擁有自己的遺傳物質(zhì)和遺傳體系。誠然，線粒體的代謝與生物功能受核基因和mtDNA共同調(diào)控，且目前發(fā)現(xiàn)與線粒體功能和遺傳有關(guān)的基因大約有1 500個，但只有37個基因存在于mtDNA內(nèi)。由于mtDNA自我修復系統(tǒng)較差，缺乏組蛋白保護，導致了mtDNA具有高突變率(是核基因的10～20倍)的特性[21,22]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，非母系遺傳EH組及母系遺傳EH組線粒體tRNA基因發(fā)生的總突變率分別為0.12%和0.28%，遠高于對照組的0.05%，提示EH的發(fā)生與線粒體tRNA基因突變存在密切的相關(guān)性，這可能與高血壓人群中AngⅡ升高有關(guān)。AngⅡ能使細胞內(nèi)ROS增多，損傷mtDNA。但0.12%與0.28%比較，差異無統(tǒng)計學意義，我們認為這和母系遺傳組納入人群例數(shù)較小有關(guān)。

為進一步明確母系遺傳EH與mtDNA突變的關(guān)系，我們對具有母系遺傳特征的EH家系進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了3個家系僅有1個線粒體tRNA基因位點突變，分別為mtDNA A5823G、mtDNA T4386C和mtDNA C15910T。因為mtDNA是唯一表現(xiàn)為母系遺傳的DNA，而3個家系的EH表現(xiàn)為典型的母系遺傳，且這3個家系的線粒體tRNA基因就僅發(fā)現(xiàn)一個位點的突變，提示這3個位點突變體在母系遺傳發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用。值得注意的是，mtDNA 15910為線粒體tRNAThr基因D-loop臂的一個堿基，與15897位點G形成D-loop臂上的第一個堿基對C-G，但mtDNA15910突變?yōu)門后則不能形成堿基對，因此可能影響了線粒體tRNAThr的功能及穩(wěn)定性。mtDNA C15910T在所對比的12個物種中，對應人類mtDNA 15910位點的堿基均為C，說明該位點具有高度的保守性，且攜帶mtDNA C15910T的家系母系成員表現(xiàn)為EH集中發(fā)病，表明mtDNA C15910T與EH的發(fā)生密切相關(guān)。此外，我們通過分析A01號家系及該位點在人群中的分布發(fā)現(xiàn)，mtDNA 5597位點基因缺失與EH的發(fā)生有一定的聯(lián)系，但與母系遺傳EH關(guān)系不大。我們認為可能的原因是mtDNA 5597本身具有基因多態(tài)性，而EH在病程進展中，因AngⅡ、ROS等作用可能進一步促使該位點發(fā)生缺失，導致EH人群和正常人群mtDNA 5597位點缺失率有較明顯的差異。至于確切原因，尚待進一步研究揭示。

mtDNA突變導致的疾病表現(xiàn)為典型的母系遺傳，然而并非所有線粒體病都表現(xiàn)為母系遺傳。本研究顯示，母系遺傳對EH的影響為20.73%(17/82)，低于Framingham心臟研究的結(jié)果(35.2 %)[12]。這可能與兩方面有關(guān)。一是樣本量較小，本次研究僅為收集的小樣本資料，而Framingham研究是關(guān)于1 593個家系；二是判定母系遺傳影響的標準不盡一致，我們以三代母系成員中每代都有成員診斷為EH，且至少有一代超過2例母系成員為EH患者，非母系成員EH者不能超過1例。此種近乎苛刻的條件是為了盡量避免非母系遺傳的影響，因此我們認為結(jié)果是合理的。

綜上，線粒體tRNA基因的突變與具有母系遺傳特征的EH發(fā)病有較好相關(guān)性，EH患者線粒體tRNA基因突變明顯增多。mtDNA A5823G、mtDNA T4386C及mtDNA C15910T突變與母系遺傳EH的發(fā)生可能更加密切，可能對母系遺傳EH的發(fā)生產(chǎn)生重要作用。mtDNA 5597缺失可能促進EH的發(fā)生，但與母系遺傳EH無必然聯(lián)系。另外，我們還發(fā)現(xiàn)A15號家系同樣攜帶mtDNA C15910T突變體，這就提示我們mtDNA C15910T對EH的影響較大，因此有必要作進一步研究深入分析A13及A15家系的所有母系成員。