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    蛹蟲(chóng)草多糖硫酸化修飾及抗氧化研究

    2019-08-27 07:25:24李婧婧李爽劉靜雪李鳳林
    商情 2019年29期
    關(guān)鍵詞:多糖抗氧化

    李婧婧 李爽 劉靜雪 李鳳林

    【摘要】采用醇沉法結(jié)合纖維素陰離子交換柱層析法獲得蛹蟲(chóng)草中性精多糖級(jí)份(PCm)。采用氯磺酸-吡啶法對(duì)PCm進(jìn)行硫酸化修飾改性得到硫酸化多糖(SPCm)。紫外光譜分析顯示,SPCm在260nm附近有一個(gè)硫酸酯基特征吸收峰,說(shuō)明已形成了硫酸化多糖。SPCm具有良好的抗氧化性,對(duì)DPPH自由基與超氧陰離子自由基均具有清除作用。

    【關(guān)鍵詞】蛹蟲(chóng)草 多糖 硫酸化修飾 抗氧化

    1材料與方法

    1.1材料與試劑

    蛹蟲(chóng)草子實(shí)體,由吉林市匯豐科技公司提供;無(wú)水甲酰胺、氯磺酸、吡啶、氫氧化鈉溶液、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、氯化鋇、明膠、咔唑、半胱氨酸、鹽酸、葡萄糖、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、DEAE-纖維素、氮藍(lán)四唑(NBT)、還原型輔酶(NADH)、5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)、2,6-二叔丁基對(duì)甲苯酚(BHT)等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1蛹蟲(chóng)草多糖的提取。將干蛹蟲(chóng)草進(jìn)行粉碎,過(guò)60目篩,粉末按30:1料液比加入水,80℃提取2h、離心10 min,取上清液,沉淀再重復(fù)提取3次,,合并上清液并過(guò)濾濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮到原體積1/5,然后以4︰1(v/ v)的比例加入95%乙醇沉淀(4℃, 24 h)、離心,沉淀依次無(wú)水乙醇、丙酮洗滌,干燥后獲得粗多糖組份。

    1.2.2蛹蟲(chóng)草多糖的純化。蛋白質(zhì)的去除選擇Sevag法。準(zhǔn)確稱(chēng)取蛹蟲(chóng)草粗多糖0.5g,加蒸餾水溶解至100 mL,加入Sevag試劑搖勻反應(yīng)12 min,離心除去蛋白層,反復(fù)多次,直至完全去除。濾液加入95%乙醇沉淀(4℃, 24 h),離心,沉淀用75%乙醇反復(fù)洗滌2次,獲得去蛋白后粗多糖。向去除蛋白的粗多糖溶液中加入氨水,調(diào)pH=8.5,然后滴加H2O2,溫度控制在40℃保溫,混均后會(huì)看到溶液顏色發(fā)生變化,至橙黃色時(shí),停止滴加氨水和H2O2,靜置4h后,減壓濃縮,醇析,真空干燥后保存?zhèn)溆谩⒚撋侄嗵侨苡谡麴s水中制成5 mg/mL多糖溶液,上DEAE-纖維素柱,用蒸餾水按1.0 mL/min速度洗脫,每管,測(cè)每管(10 mL)多糖含量。將小峰去除,只收集最大峰,溶液經(jīng)蒸餾水進(jìn)透析袋透析48 h、干燥后得蛹蟲(chóng)草中性精多糖級(jí)份(polysaccharide from Cordyceps militaris,PCm)。

    1.2.3硫酸酯化多糖的制備。將100mg PCm懸浮于10mL無(wú)水甲酰胺中,室溫?cái)嚢?5min,隨后加入2mL硫酸化試劑(氯磺酸和不同硫酸化反應(yīng)溶劑混合,比例按1﹕4配比)。在連續(xù)攪拌下將混合物在室溫下保持2h,然后在30℃保溫5 h。迅速冷卻至室溫后,用15%NaOH溶液中和,透析,濃縮并干燥,得到硫酸化多糖(Sulfation polysaccharide from Cordyceps militaris,SPCm)。

    1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.1硫酸化反應(yīng)的溶劑選擇:為確定適合的反應(yīng)溶劑,參考已知文獻(xiàn),以取代度為指標(biāo),選吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO為酯化反應(yīng)溶劑。

    1.3.2紫外光譜分析:將PCm及SPCm加蒸餾水按1mg/mI濃度溶液,選取在190~400nm的波長(zhǎng)進(jìn)行紫外光譜分析,獲得紫外光譜圖。

    1.3.3抗氧化能力確定:

    (1)1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除能力。將SPCm溶解在蒸餾水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。用移液槍吸取1.0 mLSPCm加入2mL DPPH溶液(6.0mg DPPH溶解在100mL中甲醇),空白對(duì)照采用1.0 mL甲醇加入2mL DPPH溶液。緩慢搖晃使其混合均勻,室溫條件下避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光度。以相同濃度的BHT溶液為對(duì)照,平行三次,取平均值。DPPH自由基的清除能力根據(jù)以下公式計(jì)算: 。式中:As-樣品吸光度;A1 -空白對(duì)照的吸光度;A3-樣品本底的吸光度。

    (2)超氧陰離子自由基(02-·)清除能力。首先將SPCm溶解在蒸餾水中制成0.05、0.1、0.2、0.25mg/ml的溶液。采用NBT-NADH-PMS方法測(cè)定超氧陰離子自由基。樣品管中依次加入1.0mL的NBT溶液(pH7.4),1.0mLNADH溶液(pH7.4)和0.1mL樣品溶液,再加入100μL PMS溶液,室溫反應(yīng)5 min,在560nm處測(cè)定吸光度。以相同濃度的BHT溶液為對(duì)照,平行三次,取平均值。

    DPPH自由基的清除能力根據(jù)以下公式計(jì)算: 。式中:A-樣品吸光度;Ac -蒸餾水替代吸光度;A3-樣品本底的吸光度。

    1.4分析測(cè)定方法

    采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖,采用氯化鋇-明膠比濁法測(cè)定取代度,計(jì)算公式如下:取代度(DS)=1.62/(32-1.02)S×100。式中:S-樣品中硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同反應(yīng)溶劑對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖取代度的影響

    選擇吡啶、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺和二甲基亞砜(DMSO)作為反應(yīng)的溶劑,其對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖(SPCm)取代度的影響見(jiàn)圖1。圖1可以看出,以吡啶、DMF、甲酰胺、DMSO作為反應(yīng)溶劑獲得對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖的取代度依次為1.22、1.17、0.86、0.43。因此選擇吡啶作為反應(yīng)最佳溶劑。其原因可能DMF、甲酰胺、DMSO極性都比吡啶弱,所以硫酸化衍生物的取代度都不大。

    2.2蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖紫外光譜分析

    蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖(SPCm)的紫外光譜見(jiàn)圖2,蛹蟲(chóng)草多糖(PCm)的紫外光譜見(jiàn)圖3.圖2、圖3可以看出,SPCm與PCm在220nm附近均有多糖的特征吸收峰;SPCm在260nm附近有一個(gè)硫酸酯基特征吸收峰,說(shuō)明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm間沒(méi)有去硫酸酯基特征吸收峰。兩者發(fā)生輕微位移不明顯,說(shuō)明多糖在硫酸化過(guò)程中基本沒(méi)降解較。

    2.3蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在0-0.2mg/mL劑量范圍內(nèi),SPCm的DPPH自由基清除活性弱于BHT,但在不斷增加的濃度下,RAP的清除作用迅速趕上并超過(guò)BHT。濃度為0.25mg/mL時(shí),SPCm與BHT的清除活性為的86.89%和80.45%。即SPCm對(duì)DPPH自由基具有良好的清除活性。

    2.4蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

    通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPCm和BHT的超氧陰離子自由基清除活性隨著其濃度的增加而增加。在0.25mg/mL時(shí),SPCm和BHT顯示74.62%和83.35%的清除活性,BHT比SPCm更有效。 結(jié)果表明,SPCm對(duì)超氧陰離子自由基具有較高的清除活性,但低于BHT。

    3結(jié)論

    采用醇沉法結(jié)合纖維素陰離子交換柱層析法獲得蛹蟲(chóng)草中性精多糖級(jí)份(PCm)。采用氯磺酸-吡啶法對(duì)PCm進(jìn)行硫酸化修飾改性得到硫酸化多糖(SPCm),獲得以下結(jié)果:

    (1)吡啶作為反應(yīng)溶劑獲得對(duì)蛹蟲(chóng)草硫酸化多糖的取代度最高,是反應(yīng)最佳溶劑。氯磺酸一吡啶法是多糖硫酸化最理想的一種方法。

    (2)糖紫外光譜分析顯示,SPCm在260nm附近有一個(gè)硫酸酯基特征吸收峰,說(shuō)明已形成了硫酸化多糖。PCm在200-400nm間沒(méi)有去硫酸酯基特征吸收峰。兩者發(fā)生輕微位移不明顯,說(shuō)明多糖在硫酸化過(guò)程中基本沒(méi)降解。

    (3)SPCm對(duì)DPPH自由基具有良好的清除活性。

    (4)SPCm對(duì)超氧陰離子自由基具有較高的清除活性,但低于BHT。

    基金項(xiàng)目:1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目《蛹蟲(chóng)草的多糖硫酸化修飾及抗氧化研究》[吉農(nóng)院合字(2018)第040號(hào)]2.吉林省教育廳十三五科技項(xiàng)目《蛹蟲(chóng)草多糖硫酸化修飾及其生物活性研究》[JJKH20180732KJ]。

    第一作者簡(jiǎn)介:李婧婧,女(漢),吉林人,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院食品科學(xué)與工程專(zhuān)業(yè)2016級(jí)本科生。通訊作者:李鳳林(1973-),男(漢),吉林人,研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)與分析。

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