QuEChERS-VADLLME-內(nèi)標法-GCMS/MS快速測定鐵皮石斛中的農(nóng)藥殘留

周敏，朱萌萌，王珍，王川丕，周婷婷，劉芯成

（綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江杭州310052）

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，其含有多糖、芪類、生物堿、氨基酸和微量元素等多種成分，具有增強免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖和養(yǎng)陰生津等多種保健功能，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，分布于福建、浙江、廣西、云南等地，是國家列為重點保護的藥用植物之一。近年來，鐵皮石斛人工繁育的關(guān)鍵技術(shù)得到了較大突破，并得到迅速的推廣和應(yīng)用，形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈。然而鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時也使消費者對其人工栽培過程中可能存在的農(nóng)藥殘留問題感到擔憂，農(nóng)藥的過度使用會嚴重影響鐵皮石斛及其產(chǎn)品的質(zhì)量[1-2]。2015 版《中國藥典》[3]雖收載了鐵皮石斛的質(zhì)量標準，但對農(nóng)藥殘留問題卻未加以嚴格控制。目前對鐵皮石斛農(nóng)殘檢測的相關(guān)報道較少[4-5]，因此，對鐵皮石斛中的多種農(nóng)藥殘留量進行檢測具有十分重要的意義。

目前，農(nóng)藥多殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8-11]、氣相色譜[12]或液相色譜[13-15]與質(zhì)譜聯(lián)用法等，而目前所用的各類前處理提取凈化方法文獻報道的加速溶劑萃?。╝ccelerated solvent extraction，ASE）、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法、凝膠色譜法（gel permeation chromatography ，GPC）等，普遍存在繁瑣耗時、操作誤差偏大，需使用大量對人體和環(huán)境有毒或有害的有機溶劑、難以實現(xiàn)自動化等缺點。因此發(fā)展省時高效、有機溶劑用量少的樣品前處理新技術(shù)己成為分析化學(xué)研究的熱點之一。

QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）是目前廣泛應(yīng)用于果蔬中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法之一[16]。分散液液微萃?。╠ispersive liquidliquid microextraction ，DLLME）是 Rezaee 等[17]于 2006年首次報道的一種前處理方法，該方法集采樣、萃取、濃縮于一體，操作簡單、快速、成本低、有機溶劑用量少、對環(huán)境友好且富集效率高，在分析領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[18-21]。本研究將渦旋輔助的分散液相微萃取技術(shù)與QuEChERS 結(jié)合，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀內(nèi)標法檢測，建立了鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留的快速分析方法。該方法簡單、高效、富集效率高，方法的準確度、精密度和靈敏度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

鐵皮石斛：市售。

乙腈（色譜純）：美國TIDE 公司；甲醇、丙酮、正己烷（色譜純）：美國J.T.Baker 公司；氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳（分析純）：華東醫(yī)藥公司；氯化鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；C18（500 g）、N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）（500 g）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

內(nèi)標品：外環(huán)氧七氯（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

標準品：特丁硫磷、五氯硝基苯、乙烯菌核利、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、殺螟硫磷、毒死蜱、三唑酮、對硫磷、二甲戊靈、腐霉利、甲氰菊酯（純度≥99.5%）：德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

TQ8040 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本島津公司；ST16R 離心機：賽默飛世爾公司；BSA2202S 電子天平：德國賽多利斯公司；EUFO-945616 漩渦混合器：TALBOYS；KQ5200E 超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；R215 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi 公司；MTN-5800 氮吹儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 儀器條件

1.2.1 氣相條件

色譜柱：Agilent 安捷倫VF-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm × 0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；柱流量：1.00 mL/min；采用程序升溫：起始柱溫80 ℃，保持0 min，以 40 ℃/min 升溫至 250 ℃，保持 0 min，再以20 ℃/min 升溫至 290 ℃保持 3.75 min，總用時 10.00 min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；載氣：高純氦氣；碰撞氣：高純氬氣，純度≥99.999%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電離方式：EI；色譜-質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；檢測器電壓：0.99 kV（+0.4 kV）；測定方式：MRM 多重反應(yīng)監(jiān)測模式；定量方式：內(nèi)標法。各農(nóng)殘的定性、定量離子和MRM 參數(shù)見表1。

表1 12 種化合物的優(yōu)化質(zhì)譜MRM 參數(shù)Table 1 Optimized mass spectrometry MRM parameters for 12 compounds

1.3 樣品前處理

將鐵皮石斛樣品搗碎后在勻漿機中勻漿，稱取2.00 g 置于15 mL 帶刻度尖底離心管，加入5.0 mL 乙腈渦旋30 s，超聲提取15 min，渦旋30 s 后，于8 000 r/min離心3min。取上清液2.0mL 加入盛有50mgPSA、50mg C18粉的塑料離心管中，渦旋1 min，然后以8 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm 濾膜待DLLME 用。

向裝有4 mL 超純水的5 mL 尖底具塞玻璃離心管中加入1 mL 上述凈化提取液，然后再加入100 μL CCl4，渦旋 30 s，以 8 000 r/min 離心 3 min。用 100 μL微量注射器取出沉積相裝入帶有內(nèi)插管的進樣瓶中，氮氣吹干，加入10 μL 20 mg/kg 外環(huán)氧七氯，再加入正己烷 90 μL 定容，待 GC-MS/MS 測定。

1.4 工作曲線的繪制

準確稱取2.00 g 勻漿的鐵皮石斛樣品（不含被測農(nóng)藥組分），稱取8 等份（其中1 份空白基質(zhì)樣品），各加入一定體積的農(nóng)殘混合標準溶液，使其終濃度為0.000 4、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/kg，按 1.3方法進行前處理后，上機分析做基質(zhì)標準曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 QuEChERS 提取劑的選擇

QuEChERS 前處理中常用甲醇、乙腈與丙酮作為農(nóng)藥殘留的提取劑，在樣品中添加一定量標準混合溶液，分別用相同體積的乙腈、丙酮、甲醇提取，結(jié)果表明，與甲醇、丙酮相比，乙腈的提取效果優(yōu)于其他，并且乙腈提取鐵皮石斛中色素、蠟質(zhì)、脂肪等非極性成分的能力相對較弱，更容易通過后續(xù)加入吸附劑除去基質(zhì)的干擾物質(zhì)，本試驗選取乙腈作為QuEChERS 過程的提取劑。提取劑種類對回收率的影響見圖1。

圖1 提取劑對回收率的影響Fig.1 Effect of extractant on recovery

2.1.1.1 提取時間的選擇

在QuEChERS 階段，提取時間是影響萃取效率的一個重要因素。提取時間過短，提取劑能對目標物提取不充分；提取時間過長，雖對目標物提取充分，但同時也會萃取出較多的基質(zhì)雜質(zhì)且耗時。本試驗選取5 min～25 min 時間來對提取時間進行優(yōu)化，結(jié)果表明，當提取時間由5 min 增加至15 min，萃取效率呈逐漸增加的趨勢，由15 min 增加至25 min，回收率基本保持不變，故15 min 作為本試驗QuEChERS 過程的最佳提取時間。

2.1.1.2 提取劑體積的選擇

提取劑體積也是影響QuEChERS 過程萃取效率的因素之一。以鐵皮石斛為研究對象，準確稱量2.00 g樣品，添加水平為100 μg/kg 時，分別考察了乙腈體積為 3、5、10、15、20 mL 時對農(nóng)藥殘留的提取效果。結(jié)果表明，采用5 mL 乙腈能達到充分提取目標分析物的目的，同時考慮到樣品經(jīng)過QuEChERS 過程后還要進VADLLME 程序，為取得較大的富集因子，本試驗選取5 mL 作為最佳提取劑體積。

2.1.1.3 吸附劑種類和數(shù)量的選擇

由于鐵皮石斛樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，如蛋白質(zhì)、脂肪，糖類，色素等成分等，本試驗選取了QuEChERS 常用凈化劑PSA、C18兩種吸附劑的4 種組合（25 mg PSA+25 mg C18、50 mg PSA+50 mg C18、100 mg PSA+100 mg C18、150 mg PSA+150 mg C18）對鐵皮石斛的乙腈提取液進行凈化，PSA 能有效去除樣品基質(zhì)中的有機酸、色素和糖類，C18能有效去除樣品基質(zhì)中的有機酸、脂肪酸、碳水化合物和色素等。結(jié)果如圖2。當加入50 mg PSA與50 mg C18時效果最好，回收率最高，本試驗選取50 mg PSA 與50 mg C18作為凈化吸附劑。

圖2 吸附劑種類和數(shù)量對回收率的影響Fig.2 Effect of the type and amount of adsorbent on recovery

2.1.2 渦旋輔助的液液微萃取（vortex-assisted liquidliquid microextraction，VADLLME）過程優(yōu)化

2.1.2.1 萃取溶劑的選擇及萃取體積的優(yōu)化

本試驗考察了二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳及氯苯4 種氯代有機溶劑作為萃取劑，以適量乙腈（1 mL）為分散劑，以各農(nóng)藥含量計算回收率，按1.3 方法進行萃取測定，通過比較回收率選擇合適的萃取劑，試驗結(jié)果見圖3。

圖3 萃取劑種類對回收率的影響Fig.3 Effect of extractant species on recovery

由圖3可知，四氯化碳與氯苯的萃取效果較好，且兩者相當，二氯甲烷的回收率為43.2%～55.2%，三氯甲烷的回收率為38.4%～54.0%，氯苯為63.2%～93.4%，四氯化碳回收率為77.8%～98.3%，雖然四氯化碳與氯苯萃取效果相差不大，但氯苯作為萃取劑時，會有更多的雜質(zhì)伴隨目標物共同被萃取，因此四氯化碳被選為最佳萃取劑繼續(xù)下面的試驗。

為考慮萃取劑體積對回收率的影響，本試驗選取了體積分別為 60、80、100、120、140 μL 的四氯化碳。結(jié)果如圖4所示。

圖4 萃取劑體積對回收率的影響Fig.4 Effect of extractant volume on recovery

由圖4可知，當萃取劑體積由60 μL 增加至100 μL時，所有農(nóng)藥的回收率均變大，然而增加至140 μL 時，回收率沒有顯著的變化，基本保持不變。故在后續(xù)試驗中，100 μL 的四氯化碳被選為最佳萃取劑體積。

萃取劑體積減少可以適當?shù)奶岣咿r(nóng)藥的富集因子，即提高沉積相中農(nóng)藥的濃度；但是萃取劑體積過小時不僅會減少沉積相的體積，導(dǎo)致自動進樣困難，而且還會造成水相中農(nóng)藥提取不完全而影響提取效率。萃取劑體積與沉積相體積的關(guān)系見圖5。

2.1.2.2 分散溶劑選擇及分散體積的優(yōu)化

本試驗中QuEChERS 階段所獲取的乙腈提取液同時作為VADLLME 過程的分散劑，分散劑的體積會對DLLME 萃取效率產(chǎn)生影響，分散劑體積太小時，不能將萃取劑完全分散到樣本溶液中形成乳濁液，而導(dǎo)致萃取效率降低，但分散劑體積過大時，目標分析物在萃取劑中的分配系數(shù)降低，也會導(dǎo)致萃取效率下降。試驗以100 μL 四氯化碳為萃取劑，考察了分散劑乙腈的體積（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）對萃取效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖5 萃取劑體積與沉積相體積的關(guān)系Fig.5 Relationship between extractant volume and sedimentary phase volume

圖6 分散劑體積對回收率的影響Fig.6 Effect of dispersant volume on recovery

由圖6可知，在 0.5 mL～1.0 mL 范圍內(nèi)，待測物的萃取富集效果隨著乙腈體積的增加而增加，在乙腈體積為1.0 mL 時達到最大值，之后萃取效果隨著乙腈用量的增加而降低。原因是隨著乙腈用量的增加，待測物在水中的溶解度也隨之增大，萃取效率降低。因此試驗中乙腈的最佳用量為1.0 mL，對于接下來的試驗，1.0 mL 的乙腈提取液被確定為最優(yōu)分散劑體積。

2.1.2.3 萃取時間的選擇

萃取時間對回收率的影響見圖7。

圖7 萃取時間對回收率的影響Fig.7 Effect of extraction time on recovery

本方法中萃取時間是指從樣品溶液中注入萃取劑和分散劑到混合液開始離心的時間間隔。分別考察了萃取時間為 10、20、30、40、50、60 s 時方法的萃取效率。由圖7可知，萃取時間30 s 后萃取效果基本趨于穩(wěn)定，回收率最高，之后時間增加對萃取效率沒有顯著地影響，因為在混合液形成乳濁液之后，四氯化碳被均勻的分散在了水相中與待測物接觸面積大，待測物可以快速的由水相轉(zhuǎn)移到有機相并且很快的達到兩相平衡。本試驗選取萃取時間為30 s。

2.1.2.4 離心機轉(zhuǎn)速和時間的選擇

離心機轉(zhuǎn)速對回收率的影響見圖8。

圖8 離心機轉(zhuǎn)速對回收率的影響Fig.8 Effect of centrifuge speed on recovery

本試驗采用塑料離心管離心，通過選用不同轉(zhuǎn)速，觀察離心分層效果，結(jié)果表明，在8 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心后，會取得比較好的分層效果，因此本試驗最終確定離心機轉(zhuǎn)速為8 000 r/min。

離心時間對回收率的影響見圖9。

對于離心時間，本試驗選擇了8 000 r/min 離心3、5、10、15 min，結(jié)果表明，離心時間并不影響萃取效率。故離心時間選擇3 min。

2.1.2.5 鹽對萃取效果的影響

通過在水相中加入NaCl（0～10%）的方法考察了鹽濃度對萃取效率的影響。隨著NaCl 濃度的增大，12種農(nóng)藥的回收率變化很小，但是富集倍數(shù)顯著下降。這是由于離子強度的增加使有機萃取劑在水相中的溶解度減小，最后得到的有機沉積物的體積增加所造成的。所以本試驗不加鹽。

2.1.2.6 樣品溶液pH 值的影響

通過在水相中加入磷酸二氫鈉或氫氧化鈉稀溶液，調(diào)解待測溶液 pH 值分別為 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，pH 值對回收率的影響見圖10。

由圖10可知，pH 值為7.0 時回收率最高，可能是過酸或過堿破壞了目標物的分子結(jié)構(gòu)，回收率不穩(wěn)定。所以本試驗確定樣品溶液的pH 值為7.0 時為最佳條件。

圖9 離心時間對回收率的影響Fig.9 Effect of centrifugal time on recovery

圖10 pH 值對回收率的影響Fig.10 pH to the influence of recovery

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇MRM 模式下的離子對進行各農(nóng)藥的分析。為了獲得最佳的質(zhì)譜條件，保證對分析物定量和定性的準確性，對待測物的母離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等一系列質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化。一定濃度下的12 種化合物混標MRM 色譜圖見圖11。

2.3 方法的富集倍數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限

在最優(yōu)的試驗條件下，對系列濃度的標準溶液進行萃取測定，12 種農(nóng)藥殘留在0.002 mg/kg～0.5 mg/kg范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.353 μg/kg～1.14 μg/kg（S/N≥3），定量下限為 1.06 μg/kg～3.43 μg/kg（S/N≥10），富集倍數(shù)可以達到 47 倍～106 倍，可滿足實際樣品的測定。12 種農(nóng)藥殘留的檢出限（limit of detection，LOD）、定量下限（lower limit of quantitation，LOQ）、線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。

結(jié)果表明，本方法中12 種農(nóng)藥殘留的檢出限遠低于現(xiàn)行的《中華人民共和國藥典》2015年版第四部中2341 農(nóng)藥殘留量測定方法檢出限。

2.4 方法的回收率

在最優(yōu)的試驗條件下，選用陰性鐵皮石斛樣品，進行不同添加濃度的萃取、測定。對12 種農(nóng)藥殘留添加含量分別為0.001、0.01、0.05 mg/kg 的鐵皮石斛樣品平行萃取測定6 次，測得鐵皮石斛中，12 種農(nóng)藥的加標回收率為77.5 %～97.7 %，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.6%～8.4%，試驗結(jié)果見表3。鐵皮石斛空白基質(zhì)見圖12。

圖11 12 種農(nóng)藥混標的MRM 色譜圖Fig.11 MRM chromatogram of 12 pesticides mixed

表2 12 種農(nóng)藥的檢出限、定量下限、線形回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 2 LODs，LOQs，regression equation，correlation coefficient and linear equation of 12 kinds of pesticides

續(xù)表2 12 種農(nóng)藥的檢出限、定量下限、線形回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Continue table 2 LODs，LOQs，regression equation，correlation coefficient and linear equation of 12 kinds of pesticides

2.5 與中國藥典方法比較

本方法與現(xiàn)行的《中華人民共和國藥典》2015年版第四部中2341 農(nóng)藥殘留量測定方法進行比較，通過對檢出限和空白鐵皮石斛樣品用2 種不同方法進行添加回收試驗比較可以看出：本試驗在方法檢出限和回收率上均取得相對較為理想的結(jié)果，且前處理方法簡單，試劑耗材用量少，對環(huán)境友好，完全能夠滿足日常的鐵皮石斛樣品的檢測工作。具體比較見表4。

表3 不含本底樣品中各種農(nóng)藥的添加回收率和精密度（n=6）Table 3 The rate pesticide of recovery and relative standard deviation of in blank sample（n=6）

圖12 鐵皮石斛空白基質(zhì)圖Fig.12 Blank matrix of Dendrobium candidum

表4 與中國藥典方法12 種農(nóng)藥檢出限和回收率的比較（添加量0.05 mg/kg）Table 4 Compared of two method about LODs and Recovery of 12 kinds of pesticides（Added 0.05 mg/kg）

2.6 不同鐵皮石斛樣品基質(zhì)的檢測

中藥材成分復(fù)雜，對于農(nóng)藥殘留的檢測也有一定的影響。本試驗對鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)進行了研究，使用PSA 和C18小粉凈化后結(jié)合GC-MS/MS 采集數(shù)據(jù)及未凈化后樣品結(jié)合GC-MS/MS 采集數(shù)據(jù)，分別使用丙酮溶液和空白基質(zhì)溶液配置農(nóng)藥混合標準溶液并建立標準曲線，通過比較兩組標準曲線的斜率考察基質(zhì)效應(yīng)的影響，結(jié)果見表5。

表5 各農(nóng)藥組分標準曲線斜率的比值Table 5 Ratios of calibration curve slope of pesticides

由表5可知，兩組標準曲線斜率的比值分別在0.975～1.286 和 0.944～1.091 之間，說明使用 PSA 及 C18小粉凈化后結(jié)合GC-MS/MS 方法有效去除了鐵皮石斛中的大部分色素和油脂等雜質(zhì)，從而減少了農(nóng)藥組分的基質(zhì)效應(yīng)。為了避免藥材本身帶來的基質(zhì)效應(yīng)，采取基質(zhì)混合標準品溶液的方法消除和減弱基質(zhì)效應(yīng)，同時利用選擇離子定量檢測也可以大大提高分析方法的選擇性，排除一些雜質(zhì)的干擾。在對不同鐵皮石斛樣品的檢測中發(fā)現(xiàn)：雖然鐵皮石斛樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，有幾個較大雜質(zhì)干擾峰，但通過凈化、離心、基質(zhì)標樣消除干擾和GC-MS/MS 聯(lián)用檢測，能基本滿足要求。

2.7 樣品測定

用本方法檢測了各地具有代表性的鐵皮石斛樣品共100 批次，發(fā)現(xiàn)毒死蜱和五氯硝基苯這2 個農(nóng)藥有檢出，但均未超標，符合使用要求。

3 結(jié)論

本研究將渦旋輔助的分散液相微萃取技術(shù)與QuEChERS 結(jié)合，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀內(nèi)標法檢測，建立了鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留的快速分析新方法。方法優(yōu)化了前處理，各參數(shù)的色譜、質(zhì)譜條件，且靈敏度高，檢出限為 0.353 μg/kg～1.14 μg/kg，方法的準確度（回收率為77.5%～97.7%），精密度（相對標準偏差為0.6%～8.4%），均能很好地滿足不同鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留的分析要求。目前分散液相微萃取技術(shù)還主要用于簡單基質(zhì)成分，而本試驗的結(jié)果表明，該技術(shù)通過與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，用內(nèi)標法定量，應(yīng)用于鐵皮石斛樣品和多種農(nóng)藥殘留也可取得滿意的結(jié)果，這對于拓寬分散液相微萃取技術(shù)的應(yīng)用范圍具有指導(dǎo)意義。