富鋅栽培平菇的胞外酶變化規(guī)律

馮光志，劉曉敏，黎玉婷，沈彩奕，王溢華，石玉

（武漢設(shè)計工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢430205）

平菇（Pleurotus ostreatus）又稱糙皮側(cè)耳，隸屬擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬食用菌，是世界上栽培廣泛的食用菌之一[1]。平菇肉質(zhì)肥厚，味道鮮美，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，而且還具有較高的醫(yī)療保健價值，是名副其實的健康食品[2-6]。隨著生活水平的不斷提高，人們對健康飲食越發(fā)重視，對平菇的需求也日益旺盛。鋅是人體必需微量元素，缺鋅可導(dǎo)致各種生理生化異常，如生長遲緩、免疫功能受損、認知障礙、過早死亡等[7]。食品中以游離態(tài)存在的鋅不易被人體吸收，且具有一定毒性，通過利用平菇的富集作用，將鋅鹽中無機形態(tài)的鋅，與平菇體內(nèi)的多糖、蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、小肽等生物分子結(jié)合，形成易于人體吸收且毒性小的有機鋅，更有利于鋅的免疫功能和平菇保健功能的發(fā)揮，提高平菇品質(zhì)[8]。

已有研究表明不同種類金屬離子及其不同濃度梯度對食用菌菌絲生長發(fā)育、生物轉(zhuǎn)化率及子實體重金屬含量均有影響[7-13]。平菇在栽培生長的過程中會合成多種木質(zhì)纖維素降解酶，以分解秸稈和麩皮中的纖維素和木質(zhì)素，通過測定平菇菌絲體生長過程中的酶活，可以考察平菇對培養(yǎng)基料中纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的利用情況。該試驗通過袋料栽培研究不同濃度Zn2+對平菇生長和胞外酶活性的影響，確定平菇袋料栽培最適Zn2+濃度，以期為進一步開發(fā)富鋅食用菌產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌種平菇保藏于武漢設(shè)計工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院實驗教學(xué)中心。

硫酸鋅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉、葡萄糖、木糖、濾紙、羧甲基纖維素鈉、可溶性淀粉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、無水亞硫酸鈉、硝酸、高氯酸、雙氧水（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；木聚糖：sigma公司。

AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-S6恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；TG16-WS臺式高速冷凍離心機：湘南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SW-CJ-ZG超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備科技有限公司；722型紫外可見分光光度計：天津市普瑞斯儀器有限公司；iCE 3500型原子吸收光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）固體培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)袋料培養(yǎng)基：玉米芯58%，秸稈20%，麥麩20%，石灰1%，石膏1%，與水以1∶1.2質(zhì)量比均勻混合，分裝于培養(yǎng)袋中，每袋裝樣量180 g。

1.3 方法

1.3.1 富鋅平菇的接種栽培

在基礎(chǔ)袋料培養(yǎng)基中添加硫酸鋅，使Zn2+終濃度為 0、300、600、900 mg/kg，分別裝袋，在無菌條件下，將活化好的斜面平菇菌絲以1 cm2菌塊大小分別接種于培養(yǎng)袋中，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.2 粗酶液的制備

在平菇生長的7個時期（1：菌絲半袋；2：菌絲滿袋；3：滿袋后熟；4：菌芽期；5：伸長期；6：成熟期；7：采后），分別在無菌條件下，從培養(yǎng)袋中稱取菌絲1 g混合，置于研缽中加入10 mL的去離子水研磨，轉(zhuǎn)移至離心管中，再量取5 mL去離子水洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃，8 000 r/min下離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

1.3.3 平菇菌絲生長過程中羧甲基纖維素鈉酶（carboxymethyl cellulose enzyme，CMCase）活性的測定

向試管中加入800 μL 1%羧甲基纖維素鈉溶液、200μL粗酶液，混勻后在35℃的水浴鍋中水浴30 min，立即加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴煮沸5 min后取出冷卻，加入7.5 mL蒸餾水稀釋后，在540 nm下測定含糖量，以沸水滅活的粗酶液作為對照，設(shè)3次重復(fù)。酶活力通過反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.3.4 平菇菌絲生長過程中木聚糖酶活性的測定

向試管中加入800 μL 1%木聚糖溶液、200 μL粗酶液，方法參照1.3.3。酶活力以反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，酶活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化木糖的毫克數(shù)。

1.3.5 平菇菌絲生長過程中淀粉酶活性的測定

向試管中加入800 μL 1%可溶性淀粉溶液、200 μL粗酶液，方法參照1.3.3。酶活力通過反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.3.6 平菇菌絲生長過程中濾紙酶活性的測定

向試管中加入800 μL緩沖液、3片直徑1 cm的小濾紙片、200 μL粗酶液，方法參照1.3.3。酶活力通過反應(yīng)0.5 h內(nèi)還原糖的變化表示，活力單位為每分鐘轉(zhuǎn)化葡萄糖的毫克數(shù)。

1.3.7 Zn2+含量的測定

將采收后的食用菌子實體菌蓋和菌柄分開，在60℃烘箱中烘干至恒定質(zhì)量，采用原子吸收光譜法測定Zn2+含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn2+對平菇生長發(fā)育的影響

不同質(zhì)量濃度Zn2+對平菇菌絲生長有較大影響。隨著Zn2+質(zhì)量濃度的增加，菌絲生長速度加快，說明添加適量Zn2+會促進平菇菌絲生長。當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為600 mg/kg時，平菇菌絲生長最快，隨著Zn2+質(zhì)量濃度的進一步增大，菌絲生長速度又逐漸下降，甚至生長被抑制。從菌絲的形態(tài)、生長勢和滿袋時間看，添加600 mg/kg Zn2+處理的平菇菌絲潔白、濃密、粗壯且平菇菌絲提前長滿菌袋。

2.2 Zn2+對羧甲基纖維素酶分泌的影響

不同Zn2+添加量羧甲基纖維素酶活性變化趨勢見圖1。

圖1 不同Zn2+添加量羧甲基纖維素酶活性變化趨勢Fig.1 Changes of carboxymethyl cellulose enzyme activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

從圖1可以看出，在菌絲生長的前4個時期，不同Zn2+添加量的平菇胞外羧甲基纖維素酶活性均保持較低的活性，之后開始緩慢升高，在子實體成熟期，不同Zn2+添加量的胞外羧甲基纖維素酶活性均處于峰值，活性大小依次為：600 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+，分別為 19.87、17.15、11.75、11.42 U/g，子實體采摘后纖維素酶活性呈下降趨勢。

2.3 Zn2+對木聚糖酶分泌的影響

不同Zn2+添加量平菇木聚糖酶活性變化趨勢見圖2。

圖2 不同Zn2+添加量平菇木聚糖酶活性變化趨勢Fig.2 Changes of xylanase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

從圖2可以看出，在平菇菌絲長至半袋時，600 mg/kg Zn2+培養(yǎng)料胞外木聚糖酶活性最高，之后不同Zn2+添加量培養(yǎng)料的木聚糖酶活性均有緩慢下降，并保持穩(wěn)定，后熟期后逐漸升高，在子實體成熟期，木聚糖酶的活性均達到最大，其中活性最高的是600 mg/kg Zn2+培養(yǎng)料，為20.49 U/g，其余由大到小依次 0 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+，最大值分別為14.34、13.48、11.22 U/g。從整個周期來看，平菇木聚糖酶在菌絲生長階段活性較小，轉(zhuǎn)入生殖階段后小幅增加，子實體成熟前大幅提高，成熟期達到最大，子實體采摘后降低。

2.4 Zn2+對濾紙酶分泌的影響

不同Zn2+添加量平菇濾紙酶活性變化趨勢見圖3。

圖3 不同Zn2+添加量平菇濾紙酶活性變化趨勢Fig.3 Changes of filter paper cellulase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

從圖3可知，在菌絲生長的前4個時期，不同Zn2+添加量的平菇胞外濾紙酶活性均保持較低的活性，菌芽期后開始逐漸升高，在子實體成熟期，不同Zn2+添加量的胞外濾紙酶活性均達到最大，其中活性最高的是600 mg/kg Zn2+，為8.39 U/g，其余由大到小依次為300 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+＞900 mg/kg Zn2+，最大值分別為6.70、4.76、4.50U/g。從整個周期來看，平菇胞外濾紙酶在菌絲生長階段活性較小，后熟階段前期小幅度下降后維持穩(wěn)定，轉(zhuǎn)入生殖階段小幅增加，子實體成熟前大幅提高，成熟期達到最大，子實體采摘后降低。

2.5 Zn2+對淀粉酶分泌的影響

不同Zn2+添加量平菇淀粉酶活性變化趨勢見圖4。

圖4 不同Zn2+添加量平菇淀粉酶活性變化趨勢Fig.4 Changes of amylase activity in Pleurotus ostreatus under different Zn2+additions

由圖4可知，在平菇菌絲長至滿袋時，不同Zn2+添加量的平菇胞外淀粉酶均有小幅升高，進入后熟期后酶活開始迅速提高，并保持穩(wěn)定，在子實體成熟期胞外淀粉酶活性達到最大，其中600 mg/kg Zn2+培養(yǎng)料活性最大值為15.97 U/g，其后分別為900 mg/kg Zn2+＞300 mg/kg Zn2+＞0 mg/kg Zn2+，采摘子實體后開始逐漸下降。不同Zn2+添加量的平菇胞外淀粉酶活性變化規(guī)律總體相近。

2.6 不同質(zhì)量濃度Zn2+對平菇子實體鋅含量的影響

不同質(zhì)量濃度Zn2+影響著Zn2+在平菇子實體中的分布。

表1 不同質(zhì)量濃度Zn2+對平菇子實體鋅含量的影響Table 1 Effects of different concentrations of zinc on the distribution of zinc in the fruiting bodies of Pleurotus ostreatus

由表1可知，隨著Zn2+質(zhì)量濃度的增加，菌蓋、菌柄的Zn2+含量均逐步增加。Zn2+質(zhì)量濃度為0～600 mg/kg時，菌柄中Zn2+含量小于菌蓋；而Zn2+質(zhì)量濃度在900 mg/kg時，菌柄Zn2+含量逐漸高于菌蓋。

3 結(jié)論與討論

食用菌生長過程中會分泌多種木質(zhì)纖維素降解酶[14]，這些酶與食用菌的生長發(fā)育和培養(yǎng)料的降解息息相關(guān)[15]，目前，已有一些學(xué)者對這些酶的變化規(guī)律展開研究。安琪等[16]和胡素娟等[17]以棉籽殼、玉米芯等基質(zhì)發(fā)酵料栽培平菇，發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)配方不影響平菇胞外酶活性的變化趨勢，但影響酶活性的高低。吳周斌等[18]研究了不同培養(yǎng)料對真姬菇胞外酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)料中真姬菇菌絲分泌的同種胞外酶，其活性在各生長發(fā)育階段不同。另外，一些研究發(fā)現(xiàn)金屬離子作為食用菌生長所必需的微量元素，在食用菌生長發(fā)育中也起著重要作用。文晴等[19]以平菇為試材，分別采用平板培養(yǎng)法和棉籽殼熟料袋栽法，研究了鉀元素不同添加量對平菇生長發(fā)育的影響，表明隨著鉀元素添加量的增加，平板培養(yǎng)平菇菌絲長勢和長速均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，棉籽殼熟料栽培平菇菌絲長速和生物學(xué)效率也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢?？拙S威等[20]研究了銅對平菇生長發(fā)育的影響，表明Cu對平菇菌絲生長、原基誘導(dǎo)時間、產(chǎn)量、子實體氨基酸、蛋白質(zhì)、粗脂肪含量的影響具有顯著的濃度效應(yīng)。鋅是人體必需微量元素，富鋅食用菌成為人們迫切需求的保健美食，富鋅食用菌的栽培也已經(jīng)提上日程。曾健勇等[7]研究了鋅對大球蓋菇富集液體培養(yǎng)的影響，表明適宜濃度的鋅富集液體培養(yǎng)可以顯著提高大球蓋菇菌絲產(chǎn)量、菌絲活性物質(zhì)產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率。本研究通過在袋料培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的鋅，考察菌體生長及培養(yǎng)基中纖維素酶、木聚糖酶、濾紙酶、淀粉酶活性的變化情況，為工廠化富鋅栽培平菇提供最直接的數(shù)據(jù)。

本研究通過向秸稈基質(zhì)中添加不同濃度的Zn2+，研究結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度Zn2+對平菇分泌的同種胞外酶，其活性在各生長發(fā)育階段不同，但不影響平菇胞外酶活性的變化趨勢，這與吳周斌等[18]的研究結(jié)果相同。在平菇生長的前4個時期，胞外酶活性均很低，表明平菇在營養(yǎng)生長至原基分化初期主要降解半纖維素，而在伸長期胞外酶活迅速提高，表明子實體形成期主要降解纖維素，可見平菇胞外酶活性與其生長發(fā)育階段密切相關(guān)，并且呈現(xiàn)階段性變化。不同質(zhì)量濃度Zn2+對平菇胞外酶活性有較大影響，本研究中添加的600 mg/kg Zn2+，有效促進了平菇胞外酶的分泌，對平菇的富鋅栽培具有一定的指導(dǎo)意義。