多糖中糖醛酸含量測定方法的研究進(jìn)展

李亞平，周鴻立，2，*

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.吉林省農(nóng)業(yè)資源綜合開發(fā)與利用工程研究中心，吉林吉林132022）

糖醛酸[1]又名透明質(zhì)酸，它作為多糖分子中6位的羥甲基氧化成羧基的產(chǎn)物，是一種酸性的黏多糖。其中，某些多糖本身或具有糖醛酸結(jié)構(gòu)的多糖常表現(xiàn)出十分重要的生物活性，例如，免疫調(diào)節(jié)活性、抗病毒活性[2-3]，而這類具有特殊生理活性的多糖中糖醛酸含量一般較高。由于含有糖醛酸結(jié)構(gòu)的多糖一般存在于植物中，因此，對于從天然植物中提取的多糖，確定其分子結(jié)構(gòu)中是否含有糖醛酸殘基具有極其重要的意義，所以有必要對糖醛酸含量測定方法進(jìn)行研究。

因?yàn)樘穷愇镔|(zhì)大都沒有紫外吸收，須將其衍生化后方可進(jìn)行測定。但在實(shí)際工作中，特別是在測定天然多糖產(chǎn)物中糖醛酸含量時，發(fā)現(xiàn)測得的結(jié)果往往與實(shí)際情況有偏差，這是由于糖醛酸和中性單糖并不是獨(dú)立存在，它們可能存在于同一個糖鏈中，無法將它們分離。例如，很多多糖以酸性雜多糖的形式存在，這在測定糖醛酸含量時可能存在相互干擾的情況[4]。因此探索準(zhǔn)確測定天然多糖化合物中糖醛酸含量的方法是十分有必要的。目前多糖中糖醛酸含量測定的方法有光譜法和色譜法。本文對目前的國內(nèi)外糖醛酸的含量測定方法進(jìn)行了綜述，以期為糖醛酸的質(zhì)量控制提供參考。

1 糖醛酸含量的檢測方法

1.1 光譜法

1.1.1 咔唑-硫酸法

咔唑-硫酸法[5]是測定糖醛酸含量的方法之一，糖醛酸在濃硫酸的作用下水解成帶有-COOH的糠醛或糠醛衍生物，與咔唑試劑發(fā)生縮合反應(yīng)，生成紫紅色化合物，其呈色強(qiáng)度與糖醛酸含量成正比，可比色定量。采用咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量見如表1所示。

表1 咔唑-硫酸法對不同原材料中糖醛酸含量的測定Table 1 Determination of uronic acid content in different raw materials by carbazole sulphuric acid method

如表1所示，測定不同原材料所用硫酸硼砂和咔唑溶液的量差別不大，測定波長范圍在523 nm～530 nm，但沸水浴和顯色放置時間相差較大，水浴時間和溫度決定著多糖的水解程度，不同的多糖的單糖組成不同，水解時間和溫度也會不一樣。足夠的顯色放置時間是為了讓水解產(chǎn)物與咔唑試劑充分地絡(luò)合顯色。咔唑-硫酸法操作簡單，但是中性糖的水解產(chǎn)物也會與咔唑試劑反應(yīng)，繼而產(chǎn)生在糖醛酸的測定波長處有吸收的有色物質(zhì)，且隨著中性糖濃度的增加，其吸光度也隨之增大，使測量值偏高，且不能測出單個糖醛酸的含量。為減少咔唑-硫酸法的測量誤差，林穎等[10]提出了改進(jìn)方法，為排除中性糖的干擾或?qū)ζ錅y定結(jié)果進(jìn)行校正，采用樣品的吸光度與中性糖吸光度之差，測定結(jié)果與不含中性糖的糖醛酸實(shí)際測得吸光度基本一致，為準(zhǔn)確地提高糖醛酸含量測定方法提供了試驗(yàn)依據(jù)。楊釗等[11]采用咔唑-硫酸法測定海藻酸鈉多糖中糖醛酸的含量，利用圓二色譜法測得甘露糖醛酸和古羅糖醛酸含量之比（M/G值），根據(jù)M/G值和糖醛酸的表觀吸收系數(shù)計算得出每一種糖醛酸的含量，即海藻酸鈉中甘露糖醛酸及古羅糖醛酸的含量，圓二色譜法既能對海藻酸鈉多糖中糖醛酸的測定結(jié)果進(jìn)行校正，又可測定單個糖醛酸的含量。先采用咔唑-硫酸法測定總糖醛酸的含量，再通過圓二色譜法校正才能測出單個糖醛酸的含量，此方法雖然能夠測出不同種類糖醛酸的含量，但過程比較繁瑣，操作復(fù)雜。

1.1.2 間羥基聯(lián)苯法

糖醛酸與硫酸硼砂溶液在沸水浴中水解，水解產(chǎn)物將進(jìn)一步和間羥基聯(lián)苯反應(yīng)，產(chǎn)生粉紅色衍生物，且具有紫外吸收，在一定范圍內(nèi)，該衍生物的紫外吸收與糖醛酸含量呈線性關(guān)系，可采用比色法測定糖醛酸的含量。采用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量見表2。

如表2可知，不同種類的多糖沸水浴時間、間羥基聯(lián)苯的用量及顯色時間差別較大，但每種多糖糖醛酸的含量差別也較大，變化范圍為1.19%～67.09%。此方法雖然簡單，但中性糖對測定結(jié)果同樣有所干擾。許會生等[20]改良了間羥基聯(lián)苯法，通過制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線、葡萄糖醛酸的苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線（糖醛酸對中性糖的干擾曲線）、葡萄糖的間羥基聯(lián)苯法標(biāo)準(zhǔn)曲線（中性單糖對糖醛酸的干擾曲線），將4條曲線聯(lián)立，消除中性糖和糖醛酸的相互干擾，避免了誤差，測定結(jié)果比較準(zhǔn)確。任珍蕓等[21]添加少量氨基磺酸鹽可消除中性糖水解時產(chǎn)生的咖啡色或者茶色現(xiàn)象即消除生成非特異的顯色物質(zhì)的干擾，可以明顯使糖醛酸檢測結(jié)果更接近于真實(shí)值。另外一個重要的干擾因素是葡萄糖及半乳糖的存在對測量結(jié)果影響較大，但是甘露糖、鼠李糖及巖藻糖對糖醛酸含量的測定結(jié)果無明顯的影響。

表2 間羥基聯(lián)苯法對不同原材料中糖醛酸含量的測定Table 2 Determination of uronic acid content in different raw materials by hydroxy biphenyl method

與咔唑-硫酸法相比，中性糖對間羥基聯(lián)苯法的測定結(jié)果影響較小[22]，但改良后的間羥基聯(lián)苯能夠明顯消除中性糖的干擾。此法簡單易行，對糖醛酸的特異性比較強(qiáng)，很多天然產(chǎn)物中糖醛酸的質(zhì)量控制采用此分析方法，但該方法只能測定總糖醛酸的含量。

1.1.3 3，5-二甲基苯酚法

3，5-二甲苯酚法是糖醛酸在硫酸中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物5-甲?；?2-呋喃甲酸能夠和3，5-二甲苯酚顯色，在450 nm處有最大吸光度，可采用分光光度法測定[23]。

劉俠等[24]采用此法測定的市售蜂蜜中果膠的含量，用半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入濃硫酸、NaCl溶液、3，5-二甲苯酚顯色，但中性單糖對此方法測定結(jié)果存在一定的干擾。Vineet Kumar等[25]和馬云翔等[26]利用400 nm和450 nm雙波長吸光度計算法消除中性糖對測定糖醛酸的干擾。在測定過程中，中性糖雖然在450 nm也有一定的吸收干擾，但其最大吸收波長為400 nm，因此采用450 nm和400 nm的吸光度差，可消除的背景干擾。3，5-二甲苯酚法測定糖醛酸含量時，改良后的方法能夠減少中性糖的干擾，靈敏度高，顯色穩(wěn)定，精密度較好，線性關(guān)系良好。

1.2 色譜法

1.2.1 氣相色譜法

氣相色譜（gas chromatography，GC）以其較強(qiáng)的分辨率、快速的分析效率以及可用于定性及定量分析等優(yōu)點(diǎn)，成為多糖結(jié)構(gòu)分析中最重要的手段之一。氣相色譜能夠測定不同多糖中的單糖含量，測定結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確度高[27]，但是對于糖醛酸等糖類的分析仍然存在一定難度，因?yàn)橹行远嗵呛吞侨┧嵯噜弳挝坏奶擒真I很難被酸水解，而且糖醛酸一旦被釋放出來，容易發(fā)生內(nèi)酯化，且內(nèi)酯化程度難以重復(fù)[28]。所以氣相色譜法對多糖樣品的要求很高，需要將多糖水解成單糖，并進(jìn)行衍生化，將樣品最大程度地轉(zhuǎn)變成具有強(qiáng)揮發(fā)性的物質(zhì)。常用的衍生化方法有硅烷化和乙?；?，總結(jié)如表3，所用的檢測器為氫離子火焰檢測器、毛細(xì)管柱。

表3 氣相色譜法測定不同原材料中糖醛酸含量的條件對比Table 3 Comparison of conditions for determination of uronic acid content in different raw materials by gas chromatography

由表3可以看出，將多糖轉(zhuǎn)變成單糖的方式有酸水解和醇解，與其它3個GC的測定方法相比，豆腐渣和雞腿菇多糖[29]采用的是甘露醇進(jìn)行甲醇解，硅烷化的方式進(jìn)行衍生化。與酸水解相比，甲醇解能夠非常有效地切斷糖苷鍵，并且對單糖的破壞很小，還能夠?qū)⑻侨┧岬聂然D(zhuǎn)化為相應(yīng)的甲酯，因而大大地提高了揮發(fā)性，有利于樣品的檢測。蘋果果渣多糖[30]與另外兩個原材料的酸水解相比，在水解之后用Na2CO3溶液將內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為尿酸鈉，能夠在短時間內(nèi)將內(nèi)酯完全水解，既能縮短時間，又能使多糖完全水解，此法避免了多糖水解之后，部分糖醛酸以內(nèi)脂形式存在而不能被衍生化造成的誤差。新型細(xì)菌多糖[31]的糖醛酸衍生化方法避免使用對水分十分敏感的硅醚化試劑，衍生化非常有效，得到的測定結(jié)果準(zhǔn)確。甜菜干粕多糖[32]采用全乙?；ㄟM(jìn)行衍生化，相比于硅烷化，乙酰化既可以避免硅烷化時異構(gòu)體的產(chǎn)生，又能夠避免乙?；瘯r只能測定中性糖不能測定糖醛酸的缺點(diǎn)，并且可以同時測定其相對含量。

氣相色譜法測定糖醛酸的含量，不同的樣品水解和衍生化的條件不盡相同，需要優(yōu)化。對衍生化后的糖類具有良好的選擇性，樣品用量少，靈敏度較高，分析速度快，能同時測定多種糖醛酸的含量，具有很好的應(yīng)用前景。

1.2.2 液相色譜法

1.2.2.1 分子體積排阻液相色譜法

分子體積排阻液相色譜法是根據(jù)待測組分的分子體積大小來分離的，先將多糖水解，然后用葡聚糖凝膠色譜柱將糖醛酸分離出來并測定。糖醛酸是組成多糖的單糖之一，可以通過此法將糖醛酸與中性單糖分離。

Hirotaka Kakita等[33]采用正相分配色譜探究了微量分析糖醛酸的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)，色譜柱TSKgel Amide-80，將乙腈和磷酸二氫鉀鹽溶液流動相和柱后熒光衍生化結(jié)合起來，用紫外檢測器測定糖醛酸含量。在無鹽的有機(jī)流動相（例如乙腈和水）中，由于糖醛酸中的帶負(fù)電的羧基與二氧化硅基質(zhì)上的硅烷醇基之間的排斥，未被TSK凝膠Amide-80柱與無鹽有機(jī)流動相吸附，但添加鹽水增加了糖醛酸保留時間，但此方法中熒光衍生化時間較短，會使測定結(jié)果產(chǎn)生誤差。且糖類物質(zhì)沒有紫外吸收，所以需將水解之后的多糖進(jìn)行衍生化才能用紫外檢測器檢測。申明月等[34]采用高效液相色譜法測定茶葉多糖中糖醛酸的含量，色譜柱為Sugar-PakⅠ，流動相為乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的水溶液，檢測器為示差檢測器。示差檢測器不需要衍生化，水解之后就能測定，操作簡單，且穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，對糖類有良好的選擇性，適合于多糖中糖醛酸含量的測定。但分子體積排阻液相色譜法也有一定的缺點(diǎn)，有的單糖是異構(gòu)體，分子量相似，會導(dǎo)致其分離度不好，分離時間較長。

1.2.2.2 高效陰離子液相色譜法

高效陰離子色譜法能夠使單糖和寡糖在高pH值（pH＞12）的洗脫液中被解離成陰離子，并在陰離子柱上進(jìn)行交換分配，從而達(dá)到快速、高效地分離，是分析多糖及低聚糖中單糖組成的有效手段，見表4。

由表4可知，3種多糖中糖醛酸的含量所用的流動相的配比和流速有所不同，目的是將糖醛酸更好地分離出來。此方法是利用單糖所帶的電荷數(shù)的差異，從而達(dá)到將其分離的目的，因此糖醛酸的峰遠(yuǎn)離中性單糖的峰（中性單糖tR＜12 min），能有效的將糖醛酸與中性糖分離，大大提高糖醛酸含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且樣品不需要衍生化處理，操作簡單。采用脈沖-安培檢測器（pulse-ampere detector，PAD），能夠使其分辨率、選擇性和靈敏度大大提高，因此與其它方法相比更具優(yōu)越性，是測定糖醛酸含量的有效方法。

表4 高效陰離子色譜法測定不同原材料中糖醛酸含量的條件對比Table 4 Comparison of conditions for determination of uronic acid content in different raw materials by high performance anion liquid chromatography

2 結(jié)論

硫酸-咔唑法的咔唑試劑與中性糖反應(yīng)，使測定結(jié)果存在誤差；中性糖對間羥基聯(lián)苯法的干擾較小，但不能確定糖醛酸的種類；3，5-二甲基苯酚法操作簡單，雙波長計算法能夠排除中性糖的干擾，但3種光譜法只能測定總糖醛酸的含量。氣相色譜法樣品用量少，特別是對于單糖組成比較復(fù)雜的多糖和寡糖樣品，但需要衍生化。分子體積排阻液相色譜的分離時間較長，而陰離子液相色譜能夠很好的將中性單糖和糖醛酸分離，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，且分離速度快，不需要衍生化，所以與其他方法相比，更具有優(yōu)越性。色譜法操作方便，分辨度高，選擇性好，靈敏度大，可同時測定多個組分，對儀器的要求較高。綜上所述，幾種糖醛酸含量測定方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但隨著檢測條件和儀器精密度的提高，糖醛酸的種類和含量都會很容易的檢測出來，不同的糖醛酸之間或者是和其它中性糖能夠很好分離開，排除中性糖的干擾，糖醛酸的質(zhì)量控制也會隨之提升。