香砂養(yǎng)胃丸（水丸）的特征圖譜研究

程雅婷，王曉云，王學(xué)濤*，王艷博，劉凱娜，張上上，楊新宇，鄭 斕

（1.秦皇島市食品藥品檢驗(yàn)中心，秦皇島 066000；2.正大青春寶藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310000）

香砂養(yǎng)胃丸為納入我國基本醫(yī)療保險(xiǎn)目錄的甲類非處方藥，處方由木香、砂仁、白術(shù)、陳皮、茯苓、制半夏、醋香附、炒枳實(shí)、豆蔻（去殼）、姜厚樸、廣藿香、甘草、生姜、大棗十四味藥組成，具有溫中和胃的功效[1]。中藥成分甚多、體系復(fù)雜，測(cè)定一種或多種指標(biāo)性成分難以確保其質(zhì)量。與傳統(tǒng)中藥鑒定方法比較，特征圖譜法在藥物鑒定過程不會(huì)受到藥品形態(tài)的限制，可大幅提高檢測(cè)的穩(wěn)定性、精準(zhǔn)度、可靠性[2]，近年，已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于中藥材及中成藥的質(zhì)量控制[3-10]。市售香砂養(yǎng)胃丸質(zhì)量差異顯著[11]，目前的檢測(cè)方法研究多基于其中一種或兩種飲片、成分的質(zhì)量控制，未能形成系統(tǒng)[12-17]。筆者采用高效液相色譜建立了香砂養(yǎng)胃丸的特征圖譜，確定了12個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)了橙皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮等4個(gè)特征峰，方法快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，可用于香砂養(yǎng)胃丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），Labsolution工作站，AG-135電子分析天平（瑞士Mettler Toledo），Bandelin DL-1028H超聲波清洗器（德國Bandelin）。

1.2 試藥與試劑

橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201014，含量95.1 %），木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111524-201710，含量99.5 %），和厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)：111730-201614，含量99.3 %），厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)：111729-201513，含量98.8 %），α-香附酮對(duì)照品（批號(hào)：110748-201714，含量99.4 %）均購于中國食品藥品檢定研究院。木香、陳皮、厚樸、香附、白術(shù)藥材、藿香、甘草藥材、枳實(shí)等藥材由生產(chǎn)廠家提供，經(jīng)主任中藥師邸立杰鑒定為正品。

乙腈（MREDA，USA，色譜純），水為純凈水（娃哈哈純凈水）。

18批香砂養(yǎng)胃丸（水丸）樣品。河南省康華藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)16120802（S1）、批號(hào)16122901（S2）、批號(hào)17030701（S3），河南明善堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)161209（S4）、批號(hào)161212（S5），湖北瑞華制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)161220（S6），山西旺龍神農(nóng)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20151204（S7）、批號(hào)20161101（S8），民生集團(tuán)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)161101（S9），保定中藥制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)160302（S10），北京御生堂集團(tuán)石家莊制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)16034008（S11），江蘇平光信誼（焦作）中藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)160103（S12）、批號(hào)161102（S13），河北萬歲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)161002（S14），陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)170301（S15），藥都制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)161201 （S16）、批號(hào)170401（S17），石藥集團(tuán)河北永豐藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)10516080514（S18）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Wondasil C18-WR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相B，按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取橙皮苷、木香烴內(nèi)酯、和厚樸酚、厚樸酚、α-香附酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml各含橙皮苷620 μg/ml、木香烴內(nèi)酯52.74 μg/ml、厚樸酚51.52 μg/ml、和厚樸酚32.15 μg/ml、α-香附酮0.75 μg/ml的混合溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約2 g，研碎，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超聲處理（功率600 W，頻率35 kHz）30 min，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照藥材溶液 取處方中藥材適量，精密稱定，分別按2.2.2項(xiàng)方法操作，即得。

3 HPLC特征圖譜的建立

3.1 精密度考察

取同一批樣品（S1），按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，以厚樸酚為參比峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于3 %，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2 %，表明儀器精密度良好。

3.2 穩(wěn)定性考察

吸取同一供試品溶液（S1），分別在0，4，8，12，24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以厚樸酚為參比峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于3 %，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2 %。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 重復(fù)性考察

取同一批樣品（S1）6份，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以厚樸酚為參比峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于3 %，相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2 %。表明方法重復(fù)性良好。

3.4 特征圖譜的建立及共有特征峰的歸屬

3.4.1 特征峰的確定及指認(rèn) 取香砂養(yǎng)胃丸（水丸）18批（S1～S18），按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。供試品色譜中，共確定12個(gè)特征峰。經(jīng)與混合對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜峰比對(duì)分析，可指認(rèn)出：峰1來源于木香，峰6來源于陳皮，峰8、11來源于厚樸，峰9和峰12源自于醋香附，峰10源自于白術(shù)，峰2為藿香和甘草共同所有，3、4、5號(hào)峰為陳皮和枳實(shí)共同貢獻(xiàn)，峰7為木香和陳皮共同貢獻(xiàn)；可以確定的化合物有：4號(hào)峰為橙皮苷，8號(hào)峰為和厚樸酚，11號(hào)峰為厚樸酚，12號(hào)峰為α-香附酮。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品、樣品、對(duì)照藥材溶液和溶劑HPLC圖

3.4.2 特征圖譜共有模式的建立及分析 采用國家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012年版）進(jìn)行分析，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)置為0.2 min，經(jīng)全譜匹配共確立12個(gè)共有峰，并生成對(duì)照指紋圖譜（平均值法），建立香砂養(yǎng)胃丸特征圖譜共有模式，見圖2。在12個(gè)共有峰中，峰11（厚樸酚）與相鄰峰分離完全，對(duì)稱性好，峰面積適中，故設(shè)定為參照峰。計(jì)算各特征峰相對(duì)于參照峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果18批樣品中各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間均在規(guī)定值的±5 %之內(nèi)：0.107 （峰1），0.386 （峰2），0.419（峰3），0.443 （峰4），0.539 （峰5），0.780 （峰6），0.805 （峰7），0.889 （峰8），0.902 （峰9），0.927 （峰10），1.000 （峰11，厚樸酚，S），1.046 （峰12）。共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積及歸屬詳見表2～表4。

圖2 18批香砂養(yǎng)胃丸特征圖譜共有模式（S1～S18）和對(duì)照指紋圖譜

表2 18批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間及峰歸屬

表3 18批樣品（S1～S18）共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 18批樣品（S1～S18）共有峰相對(duì)峰面積

3.4.3 指紋圖譜相似度分析 在特征圖譜共有模式下，計(jì)算18批樣品相對(duì)于對(duì)照指紋圖譜的相似度（R），結(jié)果均大于0.90，表明各廠家間制劑工藝較穩(wěn)定，各樣品一致性較好，見表5。

表5 18批樣品（S1～S18）指紋圖譜相似度分析

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇

香砂養(yǎng)胃丸（水丸）處方由14味中藥飲片組成，成分復(fù)雜，為盡可能多提取出各組分，先后考察了甲醇、甲醇-水（50:50）為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)各組分在甲醇中含量更高，故選用甲醇為提取溶劑。

4.2 提取方法的選擇

考慮到處方中木香、砂仁、豆蔻等有效成分均為揮發(fā)性成分，受熱易揮發(fā)而造成損失，故采用超聲提取，并對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行考察，最終選用超聲處理30 min為提取方法。

4.3 檢測(cè)波長的選擇

本試驗(yàn)探索初期采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)200～400 nm波長范圍進(jìn)行光譜掃描，并對(duì)記錄的光譜圖像進(jìn)行篩選，最終發(fā)現(xiàn)在254 nm波長時(shí)，基線穩(wěn)定，各特征峰的峰形較好，峰高適宜，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長。

4.4 耐用性考察

4.4.1 色譜柱耐用性考察 考察了Shim-pack VP-ODS色譜柱、Wondasil C18-WR色譜柱、Inertsil ODS-SP、Zorbax SB-C18色譜柱及Boston Green ODS色譜柱（規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm），發(fā)現(xiàn)不同色譜柱在相同條件下的液相色譜圖有所差異。島津品牌的色譜柱如Shim-pack VP-ODS、Wondasil C18-WR、Inertsil ODS-SP均能滿足試驗(yàn)要求，而Zorbax SB-C18、Boston Green ODS等色譜柱的分離行為差異較大。為達(dá)到重復(fù)性要求，本試驗(yàn)色譜柱耐用性采用Wondasil C18-WR、Shim-pack VP-ODS、Inertsil ODS-SP色譜柱，試驗(yàn)結(jié)果一致。

4.4.2 儀器耐用性考察 分別采用島津LC-20AT、Waters 2695及Agilent 1260型高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件對(duì)同一供試品溶液（S1）進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算記錄色譜圖，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果不同儀器下各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3 %。證明試驗(yàn)方法在不同儀器上的耐用性好。

4.5 不同枳實(shí)品種研究

對(duì)全部18批樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明，特征圖譜部分存在差異。經(jīng)過進(jìn)一步分析論證，系生產(chǎn)廠家采用的枳實(shí)品種不同引起?！吨袊幍洹?015年版規(guī)定，枳實(shí)Aurantii Fructus Immaturus為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果[1]。但已有文獻(xiàn)報(bào)道，二者所含成分差異較大[18-21]。本研究的香砂養(yǎng)胃丸的特征圖譜也能反映出制劑中枳實(shí)原料藥的差異。以酸橙入藥的香砂養(yǎng)胃丸色譜圖中，峰2（橙皮苷）前后各有一個(gè)柚皮苷和新橙皮苷峰，以甜橙入藥的樣品無此二峰，該分析結(jié)果與對(duì)應(yīng)陽性試驗(yàn)結(jié)果及查閱的文獻(xiàn)一致。