元蘑液體培養(yǎng)基配方篩選

郭 興劉繼云 李占君 王 淥 杜帛霖 王 剛

（1伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000；2黑龍江北貨郎森林食品有限公司，黑龍江伊春153000）

元蘑（Hohenbuehelia serotina）隸屬真菌界真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科亞側(cè)耳屬[1]，又稱亞側(cè)耳、黃蘑、凍蘑。元蘑具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，其質(zhì)地柔嫩、味道鮮美、食味獨(dú)特，含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦質(zhì)元素等多種營養(yǎng)成分[2-3]。

在元蘑的人工栽培過程中普遍采用試管母種制作原種，再擴(kuò)大制作栽培種的固體菌種接種培育法，這種方法生產(chǎn)效率低，菌絲滿袋周期長且菌齡不一致。液體發(fā)酵生產(chǎn)液體菌種則可以克服上述缺點(diǎn)，是一種適合規(guī)?；?、工廠化的菌種制備技術(shù)[4]。我國的液體菌種生產(chǎn)設(shè)備和配套技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國際先進(jìn)水平[5-6]，液體菌種已應(yīng)用到黑木耳、金針菇、杏鮑菇、平菇、滑子菇、猴頭菇、白靈菇、蛹蟲草、靈芝等食用菌上[7-16]。筆者對(duì)元蘑進(jìn)行液體培養(yǎng)基配方的篩選，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試元蘑菌株采購于吉林省敦化市明星特產(chǎn)科技有限責(zé)任公司。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

斜面/固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g（去皮后切成小片，加適量蒸餾水，煮至呈軟泥狀，四層紗布過濾后取濾液），葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH自然，蒸餾水定容至1000 mL。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：葡萄糖3 g/100 mL，蛋白胨0.3 g/100 mL，磷酸二氫鉀 0.1 g/100 mL，硫酸鎂0.05 g/mL，pH 自然。

1.1.3 其他材料

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鈣、七水合硫酸亞鐵、七水合硫酸鋅、氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉為國產(chǎn)分析純；VB1、VB2、VB6、VC、玉米粉、黃豆粉、小米粉，為國產(chǎn)食品級(jí)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)，蘇州廣源凈化科技有限公司；HZ-2111KB立式震蕩培養(yǎng)箱，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；AL-104高精度電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZB-718便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與接種

分別配制PDA斜面培養(yǎng)基，將原始菌株接種到其中，再將其放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，對(duì)其進(jìn)行傳代活化。

1.2.2 培養(yǎng)方法

在無菌條件下，分別將10個(gè)活化的菌株接入供試培養(yǎng)基中（150 mL培養(yǎng)液裝于250 mL三角瓶中）、溫度25℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)7 d后，結(jié)束培養(yǎng)，測(cè)定菌絲生物量。

1.2.3 碳源試驗(yàn)

單因素碳源試驗(yàn)，碳源分別為3 g/100 mL的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、小米粉。

1.2.4 氮源試驗(yàn)

單因素氮源試驗(yàn)，氮源分別為0.3 g/100 mL的蛋白胨、黃豆粉、酵母膏、尿素、硫酸銨。

1.2.5 不同無機(jī)鹽及添加量對(duì)發(fā)酵的影響試驗(yàn)

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基中的KH2PO4含量設(shè)置為0.05 g/100 mL、0.1 g/100 mL、0.15 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.25 g/100 mL。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基中的MgSO4含量設(shè)置為0.01 g/100 mL、0.03 g/100 mL、0.05 g/100 mL、0.07 g/100 mL、0.09 g/100 mL。

配制5組發(fā)酵培養(yǎng)基，額外分別按0.3 g/100 mL添加 FeSO4·7H2O、CaCO3、NaCl、ZnSO4，以不添加為空白對(duì)照。

1.2.6 不同維生素對(duì)發(fā)酵的影響

分別在基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基中，添加0.001%的VC、VB1、VB2、VB6配制4組發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.7 試驗(yàn)測(cè)定方法

菌絲體生物量的測(cè)定：將培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液倒入抽濾瓶中，抽濾，抽濾過程中流動(dòng)地加入些許蒸餾水對(duì)菌絲體進(jìn)行沖洗，抽濾后得到較干的菌絲體，再放置于烘箱中，溫度設(shè)置為60℃，待完全烘干后，稱重[17]。

所有單因素和正交試驗(yàn)均重復(fù)三次。采用SAS9.2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析。

1.2.8 正交優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以最佳碳源、最佳氮源、無機(jī)鹽、維生素4個(gè)影響因子采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)平行（150 mL培養(yǎng)液分裝于250 mL錐形瓶中），25℃，150 r/min搖床培養(yǎng)7 d后，過濾收集菌絲球并洗凈，于60℃烘箱中完全烘干后稱重，記錄每組各瓶菌絲體干重并計(jì)算平均值。

圖1 不同碳源對(duì)菌絲體生物量影響

圖2 不同氮源對(duì)菌絲體生物量影響

圖3 KH2PO4對(duì)菌絲生物量的影響

圖4 MgSO4對(duì)菌絲生物量的影響

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源試驗(yàn)結(jié)果

從圖1可知，元蘑菌絲體對(duì)玉米粉的利用效果較好，菌絲體生物量（干重，下同）達(dá)到1.06 g/100 mL，而對(duì)于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、小米粉的利用效果較差，菌絲生物量也相對(duì)偏低。因此選擇玉米粉作為試驗(yàn)最佳碳源，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 氮源試驗(yàn)結(jié)果

從圖2中可知，以酵母膏作為氮源時(shí)，利用效果最好，菌絲體生物量為0.88 g/100 mL，對(duì)黃豆粉和蛋白胨的利用效果次之；但是當(dāng)?shù)礊槟蛩?、硫酸銨時(shí)，所得的菌絲生物量較低，這表明元蘑幾乎不能利用無機(jī)氮源。因此選擇酵母膏作為最佳氮源，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 無機(jī)鹽及其添加量試驗(yàn)結(jié)果

在培養(yǎng)基中添加不同量的KH2PO4和MgSO4，結(jié)果見圖3、圖4。

由圖3可知，較低濃度KH2PO4有利于元蘑菌絲生長，添加量為0.1 g/100 mL時(shí)達(dá)到菌絲生物量最大，為0.78 g/100 mL，之后隨著添加量的增加，菌絲生物量逐漸減少，因此適宜KH2PO4的添加量為0.1 g/100 mL。

由圖4可知，低濃度的MgSO4有利于元蘑菌絲生長，添加量為0.03 g/100 mL時(shí)菌絲生物量達(dá)到最大，為0.68 g/100 mL，之后隨著添加量的增加，菌絲生物量逐漸減少，因此適宜MgSO4的添加量為0.03 g/100 mL。

由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基中添加FeSO4、CaCO3、NaCl、ZnSO4后，抑制元蘑菌絲生長，抑制作用ZnSO4＞FeSO4＞CaCO3＞NaCl，因此這 4 種無機(jī)鹽均不適合制作元蘑的液體培養(yǎng)基。

圖5 不同無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生物量影響

2.4 維生素試驗(yàn)結(jié)果

從圖6中可知，添加0.001%的VB1和VB2可以促進(jìn)菌絲體的生長，尤其是VB1，菌絲生物量為1.19 g/100 mL，而添加0.001%的VC、VB6，反而會(huì)抑制菌絲體的生長，抑制效果：VB6＞VC。因此選擇VB1作為最佳維生素。

圖6 不同維生素對(duì)菌絲體生物量影響

2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定玉米粉作為最佳碳源，酵母膏作為最佳氮源，KH2PO4和MgSO4為無機(jī)鹽，VB1作為最佳維生素。選取最佳碳源、最佳氮源、無機(jī)鹽和維生素4個(gè)因素作為影響因子，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，影響菌絲體生物量的主次因素為維生素＞氮源＞碳源＞無機(jī)鹽，最佳組合是A3B3C2D2，根據(jù)試驗(yàn)確定元蘑液體最佳培養(yǎng)基配方為：玉米粉4%、酵母膏0.4%、KH2PO40.1%、MgSO40.03%、VB10.002%。

3 小結(jié)

通過不同碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素的篩選并結(jié)合優(yōu)化正交試驗(yàn)，筆者試驗(yàn)結(jié)果表明，元蘑液體培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基配方為：玉米粉4%、酵母膏0.4%、KH2PO40.1%、MgSO40.03%、VB10.002%。