試劑盒聯(lián)合硅膠膜法提取陳舊性骨骼和牙齒DNA

張 科，周小強(qiáng)

骨骼和牙齒是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中常見(jiàn)的生物檢材，其DNA檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)于身源查找可能是唯一的識(shí)別依據(jù)。骨組織內(nèi)的細(xì)胞由于被鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)所保護(hù)，即使面對(duì)各種外界環(huán)境也可以得到長(zhǎng)期有效的保存，這是檢驗(yàn)的基礎(chǔ)，但這也大大增加了提取難度。在這類檢材的提取方法研究中，先后出現(xiàn)了CTAB法[1]、硅珠法[2]、壓力循環(huán)儀法[3]等，但這些方法需要EDTA長(zhǎng)時(shí)間脫鈣或純化，操作步驟相對(duì)繁瑣，提取難度較大，同時(shí)也因操作環(huán)節(jié)繁瑣，提高了樣品污染的概率。如何從中獲得高質(zhì)量的DNA模板和滿意的STR分型，是法醫(yī)物證檢驗(yàn)鑒定工作必須正視的挑戰(zhàn)。利用PrepFiler Express BTATM試劑盒結(jié)合Automate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)提取系統(tǒng)對(duì)骨骼牙齒的提取已有報(bào)道[4]，其裂解能力、提取效率、獲得模板的質(zhì)和量較其他提取方法有較大的優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)PrepFiler Express BTATM試劑盒聯(lián)合硅膠膜法建立陳舊性骨骼牙齒DNA檢材的提取方法，旨在實(shí)際工作中充分拓展該試劑盒的應(yīng)用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源選取骨骼10份(依次編為1～10號(hào))，牙齒10份(依次編為11～20號(hào))，均來(lái)自于日常檢案收集的不同個(gè)體樣本。上述樣本經(jīng)骨骼孵育液聯(lián)合硅珠法或利用PrepFiler Express BTATM試劑盒結(jié)合Automate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)提取系統(tǒng)均獲得良好分型，以為對(duì)照。

1.2 主要儀器與試劑電鉆、砸牙器(公安部物證鑒定中心)；24孔1.5 mL恒溫混勻儀(Eppendorf公司，德國(guó))；QIAcube全自動(dòng)化核酸純化儀(QIAGEN公司，德國(guó))；9700型PCR擴(kuò)增儀，3500XL型基因分析儀(Life Technologies公司，美國(guó))；PrepFiler Express BTATM試劑盒(采用其中的裂解液、蛋白酶K，LysepTM柱及裂解管)，QIAamp DNA Investigator kit(QIAGEN公司，德國(guó))，GolbalFiler試劑盒(Life Technologies公司，美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理刮去待檢骨骼樣本表層垢物并清水洗凈表面，再用無(wú)水乙醇沖洗并拭干，做好標(biāo)記，紫外燈下各面均照射15 min以上。低轉(zhuǎn)速鉆取選定部位，收集100 mg左右的骨粉置于PrepFiler裂解管內(nèi)。選擇牙根、牙冠完整無(wú)損的牙齒，刮去表層并清水洗凈表面，放入干凈的小燒杯內(nèi)，加入5%的次氯酸鈉溶液浸泡約15 min后取出，用水沖洗1 min，再用無(wú)水乙醇沖洗并拭干，做好標(biāo)記，紫外燈下照射15 min以上。砸斷牙齒根部，砸成粉末，收集100 mg左右的牙粉置于PrepFiler裂解管內(nèi)。

1.3.2 DNA的提取將20個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本分別加入PrepFile裂解液300 μL、PK10 μL(1 mol·L-1)、DTT10 μL(10 mg·mL-1)，振蕩混勻后放置在24孔1.5 mL恒溫混勻儀上1 200 r·min-1消化2 h，快速離心，盡量多地吸取其上清至1.5 mL收集管上的LysepTM柱內(nèi)，12 000 g離心1 min，棄掉濾柱。至此步驟，將上述實(shí)驗(yàn)樣本按照QIAcube全自動(dòng)化核酸純化儀操作手冊(cè)提取檢材DNA，模板DNA終體積為60 μL備檢。

1.3.3 DNA的擴(kuò)增及電泳檢測(cè)將上述20個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本采用GolbalFiler試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系10 μL，其中Mix 3 μL，Primer 1 μL，模板DNA均為6 μL，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)增加至30 cycles(循環(huán)參數(shù)視后期檢驗(yàn)情況進(jìn)行調(diào)整，其他擴(kuò)增參數(shù)同試劑盒說(shuō)明書(shū))。上述擴(kuò)增產(chǎn)物均以3500XL型基因分析儀進(jìn)行電泳分離和激光掃描分析，使用GeneMapper?ID-X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得各樣本STR基因分型。

2 結(jié)果

對(duì)20個(gè)研究樣本的DNA檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初步分析(RFU≥100，F(xiàn)ilter：10%)，以基因座上分型相同為檢出標(biāo)準(zhǔn)，排除因可能的DNA濃度過(guò)低所致優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增和無(wú)效擴(kuò)增結(jié)果。統(tǒng)計(jì)得出實(shí)驗(yàn)樣本檢出基因座數(shù)量，見(jiàn)表1。從檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，通過(guò)PrepFiler Express BTATM試劑盒聯(lián)合硅膠膜法[5]對(duì)陳舊性骨骼牙齒DNA檢材獲得了相對(duì)滿意的效果，利用GolbalFiler試劑盒檢出13個(gè)完整基因分型的占80%。從分析圖譜來(lái)看，未能檢出的基因座往往集中于D16S539、D2S1338、D18S51等較大片段。同對(duì)照樣本相比，30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的條件下，經(jīng)該方法檢驗(yàn)獲得的峰值普遍較低。

表1 文中提取方法檢出基因座數(shù)量情況

3 討論

PrepFiler Express BTATM試劑盒往往同Automate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)提取系統(tǒng)協(xié)同使用，同其他方法相比有著多方面顯著的優(yōu)勢(shì)[6]，其中BTA試劑盒的裂解能力、裂解效率和其中提供的特殊構(gòu)造的納米級(jí)磁珠是其亮點(diǎn)。本研究中的實(shí)驗(yàn)更傾向于利用BTA試劑盒的裂解能力和裂解效率以獲得較多的DNA，且前期消化裂解的過(guò)程減少了很多繁復(fù)的步驟，消除了因脫鈣可能造成的DNA損失[7]，然后通過(guò)QIAcube核酸提取儀對(duì)裂解獲得的DNA進(jìn)行純化[8]和濃縮[9]。本研究實(shí)驗(yàn)獲得了較為滿意的結(jié)果，由此表明通過(guò)實(shí)驗(yàn)試圖建立的方法可以為陳舊性骨骼牙齒類檢材的提取提供思路，對(duì)于沒(méi)有購(gòu)置Automate ExpressTM自動(dòng)化法醫(yī)提取系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室，可利用該方法手工或開(kāi)展陳舊性骨骼牙齒類檢材的檢驗(yàn)工作。

從20份實(shí)驗(yàn)樣本的結(jié)果分析來(lái)看，經(jīng)該方法檢驗(yàn)獲得的峰值普遍較低，3份骨骼樣本和1份牙齒樣本未得到滿意的基因分型結(jié)果，提示此方法實(shí)驗(yàn)流程還需進(jìn)一步優(yōu)化，以獲取更高質(zhì)量、更多數(shù)量的DNA?？紤]產(chǎn)生這一問(wèn)題的原因可能有：①兩種試劑盒所包含的試劑之間有不兼容的情況存在，影響了提取效率；②未檢出的骨骼牙齒樣本本身?xiàng)l件極差，其中就有2份骨骼長(zhǎng)期暴露于潮濕環(huán)境中，骨松質(zhì)及髓腔已高度腐敗，2份牙齒牙根處裂開(kāi)，牙髓腔內(nèi)變色。③擴(kuò)增參數(shù)、擴(kuò)增體系、適度增加Taq酶、增加引物、PCR后純化等方式進(jìn)行調(diào)整以提高檢出率還沒(méi)有進(jìn)一步的研究和實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程提示：始終不能忽視骨骼牙齒類檢材檢驗(yàn)的復(fù)雜性，由于該類檢材提取的DNA濃度較低，經(jīng)常會(huì)發(fā)生丟峰或非特異性擴(kuò)增情況出現(xiàn)。如果沒(méi)有對(duì)照樣本，仍建議通過(guò)多點(diǎn)取樣、平行試驗(yàn)、互為對(duì)照的方式，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

作者試圖建立通過(guò)PrepFiler Express BTATM試劑盒聯(lián)合硅膠膜法提取人體陳舊性骨骼牙齒DNA的研究還存在一定的局限性，對(duì)陳舊和腐敗樣本的研究還需大量實(shí)踐總結(jié)；未對(duì)該方法和其他常用方法提取的DNA進(jìn)行定量研究和對(duì)照；操作步驟和細(xì)節(jié)還未進(jìn)行精細(xì)化固定。但就實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，該方法的提取效率能夠滿足DNA實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)需求，并作為其他方法的有效補(bǔ)充。