雙酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化

馬 瑩,胡志和,2,薛 璐,2,*,潘 穎,周寶宏,賈蘊(yùn)琴,王麗娟,2,吳子健,2

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134; 2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-Converting Enzyme,ACE)是一種羧二肽酶,能使血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅱ,血管緊張素Ⅱ具有血管收縮調(diào)節(jié)功能,同時(shí)ACE能水解緩激肽,使之失去活性,使人體血壓升高[1-2]。ACE抑制肽是一類從食物中提取的具有降血壓的活性多肽[3]。ACE抑制劑的研究與開發(fā)對(duì)治療高血壓意義重大[4]。

2015年我國高血壓患者超過3億人,預(yù)防和治療高血壓已經(jīng)成為了全世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要任務(wù)。治療高血壓的化學(xué)合成藥物有卡托普利、阿拉普利等。但這些藥物會(huì)產(chǎn)生一定的副作用,如咳嗽、味覺紊亂、皮疹、不能停止服藥等,在治療高血壓方面就會(huì)受到一定的限制[5-6]。因此尋求更高效更安全的降壓藥物變得尤其重要。從食源蛋白質(zhì)中得到的降血壓肽既能使動(dòng)物體血壓適當(dāng)降低[7-8],又能保證其安全性,同時(shí)對(duì)血壓正常的動(dòng)物體沒有降壓作用,彌補(bǔ)了常見降壓藥物使血壓過度下降易誘發(fā)心臟病突發(fā)提高死亡率的不足[9]。1965年Ferreira[10]首次從南美洲蝮蛇(Bothropsjararaca)的毒液中發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。1971年Ondetti等[11]從蝮蛇中分離出1個(gè)九肽片段,并經(jīng)過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明具有抗高血壓作用。后來人們陸續(xù)從各種食物蛋白中發(fā)現(xiàn)分離出多種ACE抑制肽,諸如乳及乳制品[12-14]、發(fā)酵食品[15-16]、植物[17-19]、水產(chǎn)品[20-21]、明膠[22]、海洋藻類[23]等。本課題組胡志和等[24]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)牛乳酪蛋白進(jìn)行水解,再通過超濾和Sephadex G-15凝膠色譜法將水解產(chǎn)物純化,最終確定了一種新的ACE抑制肽YQKFPQYLQY。Lu等[25]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),自發(fā)性高血壓大鼠灌胃YQKFPQYLQY后,其收縮壓顯著降低。

螺旋藻營養(yǎng)價(jià)值很高,優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、螺旋藻多糖、人體必需微量元素以及多種維生素都是螺旋藻的重要組成成分。其蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%～70%,是自然界中具有重大開發(fā)價(jià)值的食用和餌料蛋白資源,被形象的稱為“超級(jí)微型營養(yǎng)庫”。由于其細(xì)胞壁中幾乎不含纖維素,故人體消化吸收十分容易,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測定螺旋藻的消化吸收率在90%以上,并且蛋白的消化率達(dá)75%,在當(dāng)今的社會(huì)中,蛋白質(zhì)的資源嚴(yán)重不足,螺旋藻是一種純天然品質(zhì)優(yōu)良的蛋白質(zhì)。

目前制備ACE抑制肽多為單一蛋白酶水解,很少模擬胃腸道系統(tǒng)的酶解過程。而經(jīng)其他酶水解得到的ACE抑制肽在人體消化吸收過程中,由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用,其氨基酸序列有可能會(huì)發(fā)生變化,進(jìn)而導(dǎo)致ACE抑制能力的變化。因此,本研究在課題組前期研究工作的基礎(chǔ)上,以螺旋藻藻膽蛋白為原料,采用胃蛋白酶、胰蛋白酶先后對(duì)螺旋藻藻膽蛋白進(jìn)行水解來制備ACE抑制肽。通過雙酶組合酶解產(chǎn)物在模擬胃腸道消化系統(tǒng)中的效果,得到有消化穩(wěn)定性的ACE 抑制肽。為今后抗高血壓類功能性食品研發(fā)提供新原料,并為ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鈍頂螺旋藻粉 內(nèi)蒙怡健生物制品有限公司;胃蛋白酶(≥ 250 U/mg)、N-Hippuryl-His-Leu hydrate(HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰組胺酰亮氨酸(hippuryl-histidyl-leucine,HHL)、胰蛋白酶(≥250 U/mg) 美國Sigma公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、N,N-亞甲叉雙丙烯酰胺 美國Bio-Rad公司;甘氨酸 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;Tris-堿 德國Roche公司;無水甲醇、無水乙醇、福林酚等 均為國產(chǎn)分析純。

MODUL YOD-230型冷凍干燥機(jī) Thermo公司;UV-2100型分光光度計(jì) Unico公司;FA1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;Amicon Ultra-10kDa超濾離心管、Amicon Ultra-3kDa Millipore超濾離心管 上海必泰生物科技有限公司;HL-2型恒流泵 上海滬西分析儀器廠;;電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反復(fù)凍融法和超聲波解凍結(jié)合法提取藻膽蛋白 準(zhǔn)確稱取螺旋藻粉400 g,溶于10 L的去離子水中,即料液比為1∶25 (m/v)之后將螺旋藻溶液均勻的分到6個(gè)2 L溶劑瓶中,在-80 ℃的冰箱中進(jìn)行冷凍,待螺旋藻溶液充分冷凍后取出放置于40 ℃的水浴槽中,將超聲功率固定在650 W,進(jìn)行超聲波輔助解凍。瓶子編號(hào)分別是1、2、3、4、5、6,編號(hào)1的凍融一次,編號(hào)2的凍融兩次,依次類推,在每解凍后取500 mL解凍液進(jìn)行離心,取離心的上清液,之后進(jìn)行螺旋藻粉藻膽蛋白含量的測定,蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法[27],計(jì)算蛋白質(zhì)溶出率。

蛋白質(zhì)溶出率(%)=上清液蛋白質(zhì)含量×100/螺旋藻粉中蛋白質(zhì)含量

1.2.2 等電點(diǎn)法分離蛋白 根據(jù)1.2.1反復(fù)凍融法和超聲波解凍結(jié)合法提取藻膽蛋白,收集凍融5次條件下螺旋藻粉解凍液的上清液6000 mL,上清液均勻地分裝到6個(gè)燒杯中,將0.1 mol/L濃度的稀鹽酸加入上清液中,邊滴加邊攪拌混勻,分別調(diào)節(jié)pH至3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75,靜置2 h后,溫度控制在10 ℃,以4000 r/min離心20 min,收集蛋白沉淀冷凍干燥得到粗蛋白粉末,稱量得到的粗蛋白粉末的重量。用分光光度計(jì)測量650 nm處殘余蛋白的吸光度值。吸光度值越低證明蛋白質(zhì)沉淀效果越好。

1.2.3 采用SDS-PAGE凝膠電泳法分析提取蛋白的種類 根據(jù)所測蛋白質(zhì)的帶電密度及所分離蛋白樣品的相對(duì)分子質(zhì)量大小來設(shè)計(jì)不同濃度的膠,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出分離膠及濃縮膠配方如表1。

表1 分離膠及濃縮膠配方Table 1 Separation and concentrate formulas

1.2.4 胃蛋白酶水解藻膽蛋白

1.2.4.1 水解工藝 稱取一定量的螺旋藻藻膽蛋白,以蒸餾水配成一定濃度溶液,水浴攪拌,待溫度達(dá)到所需溫度后,調(diào)節(jié)pH,按一定的酶底比加入胃蛋白酶,開始水解。在攪拌狀態(tài)下,不斷加入濃度為1 mol/L的HCl,以使pH始終維持在試驗(yàn)規(guī)定范圍內(nèi)。水解結(jié)束后,沸水浴滅酶15 min。冷卻后以轉(zhuǎn)速6000 r/min離心30 min,取上清液冷凍干燥,-80 ℃貯藏,備用。

1.2.4.2 溫度對(duì)胃蛋白酶水解藻膽蛋白 ACE 抑制率的影響 在酶與底物比為2610 U/g,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的條件下,水解溫度分別控制在27、32、37、42、47 ℃,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.4.3 酶與底物比對(duì)胃蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為37 ℃,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的條件下,酶與底物比分別控制在1044、1305、1740、2610、5220 U/g,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.4.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胃蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為37 ℃,酶與底物比為2610 U/g的條件下,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別控制在2%、4%、6%、8%、10%,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.5 胃蛋白酶水解正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選擇測得的ACE抑制率最高的試樣,將所得的底物濃度、酶與底物比、水解溫度值前后選擇兩個(gè)數(shù)值,以底物濃度、酶與底物比、水解溫度為影響因素,以ACE抑制率為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),因素水平見表2。將9組實(shí)驗(yàn)組按照1.2.4.1方法操作,所得干燥粉于-80 ℃條件下貯藏備用。

表2 胃蛋白酶水解藻膽蛋白正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels pepsin hydrolysis spirulina phycobiliprotein orthogonal experiment

1.2.6 胰蛋白酶水解單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 水解工藝 稱取一定量的經(jīng)胃蛋白酶水解后螺旋藻藻膽蛋白,以蒸餾水配成一定濃度溶液,水浴攪拌,待溫度達(dá)到所需溫度后,調(diào)節(jié)pH,按一定的酶底比加入胰蛋白酶,開始水解。在攪拌狀態(tài)下,不斷加入濃度為1 mol/L的NaOH,以使pH始終維持在試驗(yàn)規(guī)定范圍內(nèi)。水解結(jié)束后,沸水浴滅酶15 min。冷卻后以轉(zhuǎn)速6000 r/min離心30 min,取上清液冷凍干燥,-80 ℃貯藏,備用。

1.2.6.2 溫度對(duì)胰蛋白酶水解藻膽蛋白 ACE 抑制率的影響 在酶與底物比為2610 U/g,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的條件下,水解溫度分別控制在37、40、42、45、48、50 ℃,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.6.3 酶與底物比對(duì)胰蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為42 ℃,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的條件下,酶與底物比分別控制在1044、1305、1740、2610、5220、13050 U/g并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.6.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰蛋白酶水解藻膽蛋白ACE抑制率的影響 在溫度為42 ℃,酶與底物比為2610 U/g的條件下,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別控制在2%、3%、4%、5%、6%、7%,并分別測定藻膽蛋白的ACE抑制率。

1.2.7 胰蛋白酶水解正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選擇測得的ACE抑制率最高的試樣,將所得的底物濃度、酶與底物比、水解溫度值前后選擇兩個(gè)數(shù)值,以底物濃度、酶與底物比、水解溫度為影響因素,以ACE抑制率為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),因素水平見表3。將9組實(shí)驗(yàn)組按照1.2.6.1方法操作,所得干燥粉于-80 ℃條件下貯藏備用。

表3 胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels trypsin hydrolysis spirulina phycobiliprotein orthogonal test

1.2.8 水解液的超濾 將最優(yōu)條件下水解的水解液先用截留分子質(zhì)量10 kDa超濾離心管進(jìn)行超濾,超濾液再用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾,最后分別將分子質(zhì)量大于10 kDa、小于10 kDa且大于3 kDa和小于3 kDa的超濾液分別冷凍干燥后配成1 mg/mL的濃度進(jìn)行ACE抑制活性的檢測。

1.2.9 ACE抑制肽體外活性檢測方法 采用紫外分光光度法測定乳清蛋白水解ACE抑制肽的體外活性,具體實(shí)驗(yàn)條件如下表4所示。

表4 ACE抑制率體外檢測方法Table 4 The detection method of ACE inhibition ratio in vitro

按表4所示,將所有試劑依次加入到5 mL離心管中振蕩混和均勻,待反應(yīng)結(jié)束后加入1.7 mL乙酸乙酯(4 ℃),旋渦振蕩20 s,萃取反應(yīng)中產(chǎn)生的馬尿酸,混勻后放入于4 ℃下預(yù)冷過的離心機(jī)離心(4000 r/min,15 min,4 ℃),吸取1.0 mL乙酸乙酯上層液至玻璃試管中,在120 ℃的恒溫烘箱中烘干30 min,取出待試管冷卻后加入3 mL超純水溶解,旋渦振蕩20 s,用紫外分光光度計(jì)測定復(fù)溶液在228 nm處的吸光度,每組實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行,具體計(jì)算公式如下:

式中:A代表反應(yīng)體系中加入ACE抑制劑時(shí)的吸光度;B代表反應(yīng)體系中僅有ACE與HHL反應(yīng)時(shí)的吸光度,即對(duì)照;C代表空白反應(yīng)的吸光度,即空白。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用origin 8.5和Excel進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 螺旋藻粉蛋白中含量測定

通過凱氏定氮法測得螺旋藻粉中粗蛋白質(zhì)的含量為65%±2.6%,為后續(xù)的藻膽蛋白的提取和分離提供基礎(chǔ)。

2.2 反復(fù)凍融法和超聲波解凍結(jié)合法提取螺旋藻藻膽蛋白

由圖1可知,反復(fù)凍融5次的粗蛋白的溶出率為最高,為64.87%,5次之后粗蛋白的溶出率并沒有再提高,并且有下降的趨勢。

圖1 不同凍融次數(shù)螺旋藻藻膽蛋白溶出率Fig.1 Dissolution rate of spirulina protein with different freezing and thawing times

2.3 等電點(diǎn)法分離蛋白

通過圖2可知,pH由3.50到4.75,粗蛋白的提取量的趨勢為是先增長后減少,其中最低為9.26 g。其中當(dāng)pH為4.25時(shí)提取量達(dá)到最高,達(dá)到14.36 g。圖3中,當(dāng)pH逐漸增大,所測得上清液蛋白的吸光度值的趨勢則恰恰相反,先減小又增大,并且在pH為4.25時(shí),所測得吸光度值為最低,為1.306,證明此時(shí)蛋白沉淀效果最好。故綜合以上圖示可知,當(dāng)pH為4.25時(shí)等電點(diǎn)沉淀的效果為最好。

圖2 不同pH下粗蛋白提取量Fig.2 Crude protein extraction at different pH values

圖3 不同pH下上清液吸光度值測定Fig.3 Determination of absorbance of supernatant at different pH

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳法分析提取蛋白的種類

螺旋藻藻膽蛋白分為2大類,分別是藻藍(lán)蛋白、藻和別藻藍(lán)蛋白。由圖4可以看出四種分子量的蛋白質(zhì),分別為110、49、24和18 kDa。Qin等[28]發(fā)現(xiàn)β-APC(別藻藍(lán)蛋白β亞基)的分子量為18 kDa,所以圖4集中在18 kDa的條帶應(yīng)該是β-APC。其他三種分子量的蛋白猜測是不同種類的藻藍(lán)蛋白。

圖4 SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.4 SDS-PAGE gel electrophoresis注:泳道1為濃度0.5 mg/mL藻膽蛋白,泳道2為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2.5 胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解產(chǎn)物ACE抑制率的影響 由圖5可知,隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,水解產(chǎn)物ACE抑制率也在升高,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時(shí),ACE抑制率達(dá)到最高,為85.27%,之后隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,ACE抑制率下降。因此最佳底物濃度條件為6%。

圖5 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下水解產(chǎn)物的ACE抑制率Fig.5 ACE inhibition rate of hydrolysate under different substrate mass fractions

2.5.2 酶與底物比對(duì)水解產(chǎn)物ACE抑制率的影響 由圖6可見,隨著酶與底物之比的升高,水解產(chǎn)物ACE抑制率也在升高,當(dāng)酶底比達(dá)到2610 U/g時(shí),ACE抑制率達(dá)到最高,之后隨著底物濃度的升高,ACE抑制率逐漸下降。所以當(dāng)酶底比達(dá)到2610 U/g時(shí),水解產(chǎn)物的抑制率最高,為83.33%。即最佳酶底比為2610 U/g。

圖6 不同酶底比條件下水解產(chǎn)物的ACE抑制率Fig.6 ACE inhibition rate of hydrolysate under different enzyme bottom ratio conditions

2.5.3 水解溫度對(duì)水解產(chǎn)物ACE抑制率的影響 由圖7可見,隨著水解溫度的升高,水解產(chǎn)物ACE抑制率先維持穩(wěn)定,當(dāng)水解溫度達(dá)到37 ℃時(shí),抑制率達(dá)到最高,為83.33%,之后隨著水解溫度的升高,抑制率逐漸下降,因此最佳水解溫度為37 ℃。

圖7 不同水解溫度條件下水解產(chǎn)物的ACE抑制率Fig.7 ACE inhibition rate of hydrolysate under different hydrolysis temperature conditions

2.6 胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白正交實(shí)驗(yàn)條件

由表5可以看出,水解溫度、酶底比、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)這三個(gè)不同的因素對(duì)ACE抑制率的大小都會(huì)產(chǎn)生一定的影響,結(jié)果影響大小排列是A>B>C,分別代表水解溫度>酶和底物比值>底物質(zhì)量分?jǐn)?shù),通過K值越大,實(shí)驗(yàn)方案可能越優(yōu)的原則,選擇兩組A2B1C1和A2B1C3進(jìn)行實(shí)驗(yàn),A2B1C1組合條件下得到的ACE抑制率為80.26%,A2B1C3條件下得到的ACE抑制率為76.27%,與方案A2B1C2條件下得到的ACE抑制率進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示A2B1C2的條件下的ACE抑制率最高,所以最好的實(shí)驗(yàn)方案為A2、B1、C2,即水解溫度是 37 ℃,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%,酶和底物的比值是5220 U/g,在這個(gè)條件下得到的ACE抑制率為82.07%。

2.7 胰蛋白酶水解藻膽蛋白的單因素試驗(yàn)

2.7.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解產(chǎn)物的ACE抑制率的影響 由8可知,隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,水解產(chǎn)物ACE抑制率也在升高,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時(shí),ACE抑制率達(dá)到最高,為68.42%,之后隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,ACE抑制率下降。因此最佳底物濃度條件為6%。

圖8 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酶解產(chǎn)物對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.8 Effect of ACE inhibitory activity by enzymatic hydrolysates of different substrate mass fractions

2.7.2 酶與底物比對(duì)水解產(chǎn)物的ACE抑制率的影響 由圖9可見,隨著酶與底物之比的升高,水解產(chǎn)物ACE抑制率也在升高,當(dāng)酶底比達(dá)到2610 U/g時(shí),ACE抑制率達(dá)到最高,之后隨著底物濃度的升高,ACE抑制率維持平穩(wěn)后下降。所以當(dāng)酶底比達(dá)到2610 U/g時(shí),水解產(chǎn)物的抑制率最高,為68.42%。即最佳酶底比為2610 U/g。

圖9 不同酶與底物比的酶解產(chǎn)物對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.9 Effect of ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates of different enzymes to substrates

2.7.3 溫度對(duì)水解產(chǎn)物ACE抑制率的影響 由圖10可見,隨著水解溫度的升高,水解產(chǎn)物ACE抑制率逐漸升高,當(dāng)水解溫度達(dá)到42 ℃時(shí),抑制率達(dá)到最高,之后隨著水解溫度的升高,抑制率逐漸下降。所以當(dāng)水解溫度達(dá)到42 ℃時(shí),水解產(chǎn)物的抑制率最高,為68.42%。即最佳水解溫度為42 ℃。

圖10 不同酶解溫度的酶解產(chǎn)物對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.10 Effect of ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysate at different enzymatic temperatures

2.8 胰蛋白酶水解藻膽蛋白螺旋藻正交試驗(yàn)

由表6可以看出,水解溫度,酶底比,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)這三個(gè)不同的因素對(duì)ACE抑制率的大小都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。結(jié)果影響大小排列是A>B>C,分別代表水解溫度>酶和底物比值>底物質(zhì)量分?jǐn)?shù),通過K值越大,實(shí)驗(yàn)方案可能越優(yōu)的原則,也可以得到A2B1C2組合下實(shí)驗(yàn)方案最好,即水解溫度是42 ℃,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%,酶和底物的比值是5220 U/g,pH為8.0時(shí),在這個(gè)條件下得到的ACE抑制率為80.35%。

表6 胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal test of trypsin hydrolyzed spirulina phycobiliprotein

2.9 螺旋藻藻膽蛋白ACE抑制肽的超濾分離

螺旋藻藻膽蛋白酶解液經(jīng)超濾分離得到3個(gè)組分,它們的ACE抑制活性如圖11所示。A3組分的ACE抑制率高于其他組分,其中,A3組分的ACE抑制率為94.30%。

圖11 酶解物不同組分的ACE抑制活性Fig.11 ACE inhibitory activity of different molecular mass hydrolysates注:A1:>10 kDa、A2:3～10 kDa和A3:<3 kDa。

3 結(jié)論

本研究以螺旋藻為原料,首先通過反復(fù)凍融法和超聲波解凍結(jié)合法提取螺旋藻藻膽蛋白,反復(fù)凍融5次最佳,在反復(fù)凍融之后運(yùn)用等電點(diǎn)沉淀法沉淀粗蛋白,經(jīng)過pH梯度實(shí)驗(yàn),確定了最佳沉淀pH為4.25。再通過單因素實(shí)驗(yàn)以及正交實(shí)驗(yàn)證明,利用胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備有活性的ACE抑制肽時(shí),當(dāng)水解溫度為37 ℃,酶與底物比為5220 U/g,底物濃度為6%時(shí),胃蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備所得的ACE抑制肽對(duì)ACE的抑制率最高,ACE抑制率為82.07%。利用胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備有活性的ACE抑制肽時(shí),當(dāng)水解溫度是 42 ℃,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%,酶和底物的比值是5220 U/g時(shí),胰蛋白酶水解螺旋藻藻膽蛋白制備所得的ACE抑制肽對(duì)ACE的抑制率最高,ACE抑制率為80.35%。經(jīng)過超濾得到分子量小于3 kDa的藻膽蛋白酶解液,ACE抑制率為94.30%。具有較高的活性。另一方面,本研究利用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶進(jìn)行酶解,可以側(cè)面反映ACE抑制肽進(jìn)入人體后,不會(huì)因?yàn)槿梭w內(nèi)的胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解導(dǎo)致ACE抑制率發(fā)生大幅變化。研究結(jié)果有助于深入研究螺旋藻藻膽蛋白在消化道內(nèi)的消化代謝過程,并為藻膽蛋白ACE抑制肽的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。