四種測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉方法的比較

焦夢(mèng)悅,高 涵,王偉娜,田益玲

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。直鏈淀粉是具有(1-4)-α-D-葡聚糖鍵的非分支化或輕分支化線性分子,支鏈淀粉是具有α-(1,6)糖苷鍵的高度支化聚集分子。直鏈淀粉、支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)及支直比與淀粉的物理性質(zhì)、熱特性密切相關(guān),如糊化[1-4]。支直比也影響淀粉食品的老化的一個(gè)主要問(wèn)題[5]?？傊?直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量以及支直比對(duì)淀粉的功能和營(yíng)養(yǎng)特性有顯著的影響。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的對(duì)于測(cè)定支直淀粉含量的方法精確度較高,有近紅外光譜分析法[6-8]、自動(dòng)分析檢測(cè)法[9-10]、伴刀豆球蛋白法及排阻色譜分析法[11-12]。然而,因其操作復(fù)雜、儀器及試劑價(jià)格高而難于推廣應(yīng)用[13]。目前,在國(guó)內(nèi)應(yīng)用的碘親和力滴定法與碘比色法,但碘親和力滴定法用來(lái)確定直鏈淀粉含量。碘比色法中的單波長(zhǎng)法目前應(yīng)用于測(cè)定谷物中直鏈淀粉含量,而雙波長(zhǎng)法消除了直支鏈淀粉吸收峰重疊帶來(lái)的干擾,可同時(shí)測(cè)定直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量三個(gè)指標(biāo)[13]。但目前尚未有對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與單雙波長(zhǎng)應(yīng)用結(jié)合的幾種方法比較。

本試驗(yàn)主要針對(duì)碘比色法中的單雙波長(zhǎng)的應(yīng)用結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法的不同,建立四種測(cè)定淀粉中直鏈支鏈淀粉及總淀粉含量的方法。用藜麥淀粉對(duì)此方法進(jìn)行評(píng)估,最后通過(guò)測(cè)定常見(jiàn)淀粉考察其是否具有普適性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

直鏈淀粉(A0512)、支鏈淀粉(A8515) 標(biāo)準(zhǔn)品(土豆來(lái)源),Sigma公司;碘 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;碘化鉀 西隴科學(xué)股份有限公司;氫氧化鉀 天津市大茂化學(xué)試劑廠;藜麥(白藜) 山西省靜禾縣雙路鄉(xiāng)藜麥種植合作社;馬鈴薯、木薯、玉米、小麥 上海裕田農(nóng)業(yè)科技有限公司;水磨糯米粉 廣州舒可曼有限公司;大米(粳米) 北京七河源食品科技有限公司。

JJ224BC型電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;1512PHS-3CpH計(jì) 上海三信儀表廠;UV-1700PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉樣品的制備及直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 參照文獻(xiàn)[14],從藜麥、馬鈴薯、木薯、玉米、小麥中提取淀粉。按參考文獻(xiàn)[15]分別配制2 mg/mL的直鏈淀粉、支鏈標(biāo)準(zhǔn)工作液,待用。

直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液的配制:分別取直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL于50 mL容量瓶,加蒸餾水25 mL,以0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至3.5,加入0.5 mL碘試劑,配制成濃度范圍為:8～80 μg/mL的工作曲線。20 ℃靜置30 min后搖勻,待用。

支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液的配制:分別取支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 mL于50 mL容量瓶,加蒸餾水25 mL,以0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至3.5,加入0.5 mL碘試劑,配制成濃度范圍為:80～260 μg/mL的工作曲線。20 ℃靜置30 min后搖勻,待用。

混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制:分別取直鏈和支鏈淀粉工作液按照表1配制混合標(biāo)準(zhǔn)液[2],加蒸餾水25 mL,以0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至3.5,加入0.5 mL碘試劑,待用。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備Table 1 Mixed standard curve preparation

1.2.2 淀粉的四種測(cè)定方法 以蒸餾水為空白對(duì)碘溶液、40 μg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液、80 μg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液掃描液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描;以碘溶液為空白對(duì)照對(duì)40 μg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液、80 μg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液掃描液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定空白校正液。再分別對(duì)40 μg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液、80 μg/mL支鏈標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定直鏈淀粉測(cè)量波長(zhǎng)及參比波長(zhǎng);支鏈淀粉測(cè)量波長(zhǎng)及參比波長(zhǎng)。分別將1.2.1中的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液分別按表2中方法1、2所示波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定,將1.2.1中的混合標(biāo)準(zhǔn)液按表2中方法3、4所示波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。

表2 四種方法測(cè)定波長(zhǎng)Table 2 Determination of wavelength of four methods

方法1、2以淀粉濃度為橫坐標(biāo)；直鏈淀粉、支鏈淀粉測(cè)定吸光度值為縱坐標(biāo),繪制方法1標(biāo)準(zhǔn)曲線;以直鏈淀粉、支鏈淀粉測(cè)定吸光度差值為縱坐標(biāo),繪制方法2標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法3、4以淀粉在混合標(biāo)準(zhǔn)液中的百分比為橫坐標(biāo)；以直鏈淀粉、支鏈淀粉測(cè)定吸光度值為縱坐標(biāo),繪制方法3標(biāo)準(zhǔn)曲線;以直鏈淀粉、支鏈淀粉測(cè)定吸光度差值為縱坐標(biāo),繪制方法4標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 分別取直鏈淀粉工作液、支鏈淀粉工作液按表3配成檢驗(yàn)液,加入25 mL蒸餾水,按1.2.2方法測(cè)定,代入標(biāo)曲中得到淀粉含量測(cè)定值并與實(shí)際含量進(jìn)行比較。

表3 驗(yàn)證液制備Table 3 Preparation of validation solution

1.2.4 精密度試驗(yàn) 精密稱取藜麥淀粉樣品0.1000 g,料液比1∶10 g/mL石油醚脫脂8 h后,用1.2.2中四種方法分別進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.5 樣品回收率試驗(yàn) 回收率測(cè)定試驗(yàn)是驗(yàn)證測(cè)定方法準(zhǔn)確度的有效方法之一。向2 mg/mL藜麥淀粉溶液分別添加準(zhǔn)確量取的直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液[16],按表4配制回收率測(cè)定液,加入25 mL蒸餾水,測(cè)定,求其回收率。

表4 回收率測(cè)定液制備Table 4 Preparation of recovery solution

1.2.6 直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的測(cè)定 用1.2.2方法分別測(cè)定及計(jì)算馬鈴薯、木薯、小麥、玉米、赤豆、小米、大米、糯米淀粉。代入方法可得支鏈淀粉、直鏈淀粉含量。代入以下公式求得支直比。

支直比(%)=支鏈淀粉含量×100/直鏈淀粉含量

式中：支鏈、直鏈淀粉含量單位為mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件作圖,樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),最后結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈/支鏈淀粉掃描圖

如圖1所示,以蒸餾水或碘溶液為空白對(duì)淀粉-碘復(fù)合物的掃描圖。對(duì)比可得,以蒸餾水為空白時(shí),對(duì)直鏈、支鏈淀粉-碘復(fù)合物掃描250～420 nm之間吸收峰為碘溶液吸收峰;以碘溶液為空白時(shí)鏈淀粉掃描圖在536 nm處有更明顯的峰,方便等吸光度作圖法進(jìn)行分析。直鏈淀粉在638 nm處也有明顯的峰。因此選擇碘溶液作空白。

圖1 全波長(zhǎng)掃描空白校正選擇Fig.1 Selection of full wavelength scanning blank correction

參比波長(zhǎng)的差別在于標(biāo)準(zhǔn)品的差異及等吸收點(diǎn)作圖點(diǎn)選取的差異。用UV-分光光度計(jì)對(duì)直鏈/支鏈淀粉掃描液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描得吸收光譜。由圖2可知,根據(jù)雙波長(zhǎng)等吸光度點(diǎn)作圖法確定直鏈淀粉的測(cè)量波長(zhǎng)638 nm,參比波長(zhǎng)430 nm;支鏈淀粉的測(cè)量波長(zhǎng)536 nm,參比波長(zhǎng)為768 nm。此結(jié)果與劉襄河等[17]確定的直鏈淀粉的測(cè)量波長(zhǎng)630 nm,參比波長(zhǎng)480 nm;支鏈淀粉的測(cè)量波長(zhǎng)550 nm,參比波長(zhǎng)為735 nm相接近。

圖2 直鏈/支鏈淀粉波長(zhǎng)選擇Fig.2 Wavelength selection of amylose and amylopectin

2.2 四種方法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸系數(shù)比較

在上述確定的波長(zhǎng)下,按照方法1.2.2的方法做相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如表5所示。從表5可知,四種方法測(cè)定直鏈和支鏈淀粉工作曲線的決定系數(shù)都較高,只有方法4測(cè)定支鏈淀粉的決定系數(shù)較差。因此對(duì)于直鏈淀粉的測(cè)定可以選用這四種方法的任何一種,在沒(méi)有其他干擾的情況下準(zhǔn)確性還是比較高的,而支鏈淀粉選用前三種方法更好一些。

表5 直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線及決定系數(shù)Table 5 Standard curve and determination coefficient of amylose and amylopectin

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定方法的可靠性,按照實(shí)驗(yàn)方法的1.2.3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3所示:

由圖3可知,直鏈淀粉含量測(cè)定中,四種方法差異不顯著,都適用于直鏈淀粉含量測(cè)定。直鏈淀粉含量低時(shí),方法1測(cè)定值與實(shí)際值最接近,但隨著含量的增加,差值越來(lái)越大,而其他三種方法較為精確。對(duì)于支鏈淀粉,方法1與方法2、3、4差異顯著(p<0.05)。方法1偏差大,無(wú)法代表實(shí)際值,由圖4中方法2與實(shí)際值高度變化趨勢(shì)可知,方法2所得在支鏈淀粉比例變小時(shí)偏差變大,不能應(yīng)用于淀粉中直鏈/支鏈的比例測(cè)定。這是因?yàn)閷?shí)際樣品中一般都含有直鏈淀粉,直鏈淀粉在該波長(zhǎng)下的吸光度值會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。方法4所得數(shù)值與實(shí)際值偏差較大,方法3測(cè)定值更接近于實(shí)際值。綜合比較可得,方法3更適用于測(cè)定淀粉樣品中支鏈淀粉含量。

2.4 精密度測(cè)試

在本實(shí)驗(yàn)條件下,由表6可知,測(cè)定直鏈淀粉四種方法的5次實(shí)驗(yàn)值之間的一致性良好,藜麥淀粉的直鏈淀粉的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2%,說(shuō)明采取這四種方法測(cè)定淀粉樣品中的直鏈淀粉含量具有較高的精度。可得測(cè)定直鏈淀粉四種方法均一致性良好。

表6 直鏈淀粉精密度(%)Table 6 Amylose precision test(%)

但經(jīng)過(guò)支鏈淀粉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方法1無(wú)法表示實(shí)際值，之后不再討論方法1。由表7可知,測(cè)定支鏈淀粉的方法3相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于2%,方法2、4相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于5%,較方法3一致性稍差。

表7 支鏈淀粉精密度(%)Table 7 Amylopectin precision test(%)

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

直鏈淀粉回收率測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果如表8所示,無(wú)論檢驗(yàn)液中是否有加入干擾的支鏈淀粉,方法2、4的回收率都在100.16%～103.48%,方法1、3的回收率在114.44%～152.72%,RSD均<1%,說(shuō)明方法2、4分析方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,方法1、3分析方法準(zhǔn)確度較差,說(shuō)明方法2、4適合測(cè)定試驗(yàn)原料中的直鏈淀粉。

表8 直鏈淀粉各標(biāo)準(zhǔn)曲線回收率檢驗(yàn)Table 8 Standard curve recovery test of amylose

支鏈淀粉回收率測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果如表9所示,在沒(méi)有加入干擾的直鏈淀粉工作液情況下,回收率在94.85%～111.58%,RSD均<2%,說(shuō)明分析方法在無(wú)干擾下具有較高的準(zhǔn)確度和精密度?；厥章试浇咏?00%,說(shuō)明結(jié)果越好。而在加入干擾的直鏈淀粉工作液情況下,方法2、4所得測(cè)定值的回收率125.30%、139.90%與100%差值變大,表明誤差增大,這種誤差增大的情況可能與直鏈淀粉所占比例有關(guān),藜麥淀粉中直鏈淀粉所占比例小,因加入直鏈淀粉工作液,直鏈淀粉比例的增大,誤差增大,表明方法2、4并不適合測(cè)定試驗(yàn)原料中的支鏈淀粉含量。表9中樣品2方法3的回收率為94.52%,RSD<0.5%,說(shuō)明該分析方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,適合測(cè)定試驗(yàn)原料中的支鏈淀粉。

表9 支鏈淀粉各標(biāo)準(zhǔn)曲線回收率Table 9 Standard curve recovery test of amylopectin

2.6 樣品測(cè)定

如表10，測(cè)定直鏈淀粉方法中,兩種方法測(cè)定結(jié)果相似,進(jìn)行顯著性分析顯示兩種方法無(wú)差異。測(cè)定支鏈淀粉方法中,方法3、4差異顯著(p<0.05),方法2與方法3、4差異不顯著,方法2、4測(cè)定結(jié)果誤差大,對(duì)應(yīng)前面回收率實(shí)驗(yàn),可能是雙波長(zhǎng)方法受直鏈淀粉含量影響太大,導(dǎo)致結(jié)果大;淀粉品種間的差異也會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。對(duì)比可知,方法3更適用于支鏈淀粉含量的測(cè)定。因支鏈淀粉測(cè)定中方法3使用混標(biāo),對(duì)應(yīng)直鏈淀粉測(cè)定中同樣使用混標(biāo)的方法4,因此結(jié)合可方便、快捷測(cè)出其各個(gè)含量。

表10 樣品測(cè)定結(jié)果Table 10 Results of sample determination

表10中藜麥淀粉中的直鏈淀粉含量為6.00%～7.00%,與以往研究使用Con A沉淀法測(cè)定真直鏈淀粉含量(8.22%～9.30%)的研究大致相當(dāng)[18-19]。Watanabe等[20]采用凝膠滲透色譜法(GPC)測(cè)定直鏈淀粉含量,藜麥淀粉含量在5.2%～10.9%之間,與本文結(jié)果接近。表中數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相近品種或產(chǎn)地的馬鈴薯(24.97%～44.41%)[21]、木薯(15.52%～21.53%)[22]、小麥(31.4%)[23]、玉米(23%～50%)[24]、赤豆(35.43%)[25]、小米(26.29%～31.31%)[26]、大米(17.3%～18.3%)[27]、糯米淀粉直鏈淀粉占總淀粉比例的結(jié)果相近。

2.7 各淀粉總淀粉含量及支直比

表11表示了直鏈淀粉方法4結(jié)合支鏈淀粉方法3測(cè)定值所得常見(jiàn)谷物淀粉和藜麥淀粉中總淀粉含量以及支鏈淀粉與直鏈淀粉的比值?？偟矸酆繛榉謩e測(cè)得的直鏈淀粉含量與支鏈淀粉含量總和。因提純后樣品仍存在雜質(zhì),所以將分別測(cè)定的直鏈、支鏈淀粉含量數(shù)值相加得出總淀粉含量更準(zhǔn)確合理,且排除了雜質(zhì)的干擾。此方法適用于總淀粉含量的測(cè)定。此方法還可計(jì)算支直比,支直比反映谷物淀粉組成,支鏈淀粉比例含量高,將更容易受到淀粉酶的影響,表11中糯米、藜麥支直比相對(duì)更高,表明其對(duì)淀粉酶的敏感性高。支直比影響淀粉的功能特性,如糊化特性、對(duì)酶的敏感性及回生特性等,為淀粉研究提供參考價(jià)值。

表11 各淀粉總淀粉含量及支直比Table 11 Total starch content and ratio of starch to amylose

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)單、混標(biāo)與單、雙波長(zhǎng)測(cè)定方法組合的四種方法從驗(yàn)證、回收率、精密度及實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果分析,單獨(dú)測(cè)定直鏈淀粉采用方法2、4較精確;單獨(dú)測(cè)定支鏈淀粉,雙波長(zhǎng)的方法,即方法2、4不適合。而同時(shí)測(cè)定兩種淀粉則是采用方法3、4進(jìn)行結(jié)合更為準(zhǔn)確?？偨Y(jié)得到的具體方案為:測(cè)定加入碘試劑淀粉溶液638、536、430 nm處吸光度,代入以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的,A638-A430、A536與淀粉濃度得到的回歸方程,能求出支、直淀粉含量、總淀粉含量及支直比。此方法進(jìn)一步排除了雙波長(zhǎng)法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程中兩種淀粉標(biāo)準(zhǔn)品的互相干擾,可同時(shí)測(cè)定兩者含量。未來(lái)需探明谷物的特性并與淀粉組成結(jié)合起來(lái)分析以得出更系統(tǒng)的結(jié)論。