EZH2抑制劑與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用在EGFR-TKIs耐藥肺癌細(xì)胞中的作用研究

宮顥 袁茵 李永文 張洪兵 李穎 李偉婷 王攀 施睿峰 劉超 崔力元 劉紅雨 陳軍

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率及病死率，并且發(fā)病率逐年增高，居我國(guó)一些大中城市各種惡性腫瘤的首位。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌的80%[1]。早期肺癌治療主要以手術(shù)為主，但由于早期癥狀不明顯等原因，30%-40%的患者在確診時(shí)已經(jīng)錯(cuò)過(guò)手術(shù)的最佳時(shí)期，且肺癌術(shù)后也有較高的復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率[2]。對(duì)于已經(jīng)錯(cuò)過(guò)手術(shù)指征的患者臨床上大多采用以放化療為主的治療方案，然而現(xiàn)放化療的已進(jìn)入瓶頸期，無(wú)法得到進(jìn)一步的治療突破，且部分腫瘤的放化療效果并不好。

靶向治療是肺部腫瘤治療的一個(gè)新的突破口。其中，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKIs）的分子靶向藥物的研究和開(kāi)發(fā)是目前肺癌靶向治療最主要的熱點(diǎn)。最新的美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南中也明確指出：對(duì)具有EGFR敏感突變的肺癌患者，應(yīng)用EGFR-TKIs靶向藥物，納入了一線治療方案中[3]。EGFR-TKIs類(lèi)藥物的具有療效好、副反應(yīng)小、服藥方便等特點(diǎn)，在臨床上廣受患者的歡迎。自IPASS研究以來(lái)，多項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)證實(shí)第一代TKI治療EGFR突變晚期NSCLC患者療效的確切性。第一代TKI類(lèi)藥物（吉非替尼、厄洛替尼）作為一線治療EGFR突變陽(yáng)性的NSCLC的療效明顯優(yōu)于含鉑雙藥化療[4]。CONVINCE III期臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在EGFR突變的晚期肺腺癌患者中，應(yīng)用EGFR-TKIs類(lèi)藥物?？颂婺岜扰嗝狼惵?lián)合鉑類(lèi)一線治療后培美曲塞維持的療效更為明顯[5]。對(duì)于晚期EGFR突變的NSCLC患者一線采用一代EGFR-TKI類(lèi)藥物治療，不管是有效率還是無(wú)癥狀生存期（progression-free survival, PFS）均明顯優(yōu)于以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療，但應(yīng)用第一代EGFR-TKIs治療會(huì)面臨一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題：絕大多數(shù)肺癌患者會(huì)在治療后1年左右出現(xiàn)不同程度的耐藥，導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)和治療的失敗。因此，針對(duì)EGFR-TKIs耐藥及逆轉(zhuǎn)耐藥研究、聯(lián)合應(yīng)用其他類(lèi)藥物延緩耐藥周期成為目前研究的熱點(diǎn)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中除會(huì)出現(xiàn)特定基因位點(diǎn)改變及異常信號(hào)通路激活外，還會(huì)出現(xiàn)一些特殊的表觀遺傳性狀的改變，如DNA的甲基化、磷酸化或乙?；痆6-9]。EZH2是一個(gè)重要的表觀遺傳調(diào)控基因，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferase, HMT）活性，能夠?qū)M蛋白H3第27位賴氨酸三甲基（H3K27me3）催化從而抑制靶基因的表達(dá)[7]。EZH2基因在NSCLC中高表達(dá)，且表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)研究也證實(shí)應(yīng)用EZH2抑制劑能有效地降低NSCLC的侵襲和遷移的能力，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10,11]?？梢?jiàn)EZH2抑制劑在肺癌治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。同時(shí)EZH2也有望成為治療NSCLC治療的新的靶點(diǎn)，本研究主要探討EZH2抑制劑與吉非替尼聯(lián)合，是否能增加肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要儀器 PC9及其耐藥亞克隆細(xì)胞系PC9/AB2由本研究所保存。PC9具有EGFR外顯子19（E746-A750del）的缺失突變，為吉非替尼敏感細(xì)胞系。PC9/AB2細(xì)胞是通過(guò)PC9細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于吉非替尼建立出的吉非替尼耐藥細(xì)胞系，在培養(yǎng)過(guò)程中在培養(yǎng)基中持續(xù)加入10 μmol/L的吉非替尼以維持其耐藥性。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自GIBCO公司（GIBCO-BRL, Grand Island, NY）EZH2抑制劑GSK343、吉非替尼（gefitinib）購(gòu)自Selleck，CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，EdU試劑盒購(gòu)自銳博生物公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司，P-EGFR抗體購(gòu)自Abcam公司，EGFR抗體、EZH2抗體、Histone H3、H3K27me3抗體來(lái)自Cell Signaling Technology公司（Danvers, MA, USA），β-actin抗體購(gòu)自Sigma公司（Kansas, Missouri, USA），流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman coulter公司（CA, USA）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 PC9及PC9/AB2細(xì)胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)，將細(xì)胞置于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，放入37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，直至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行細(xì)胞傳代，GSK343、gefitinib溶于于二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）溶液中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求處理細(xì)胞。

1.3 CCK-8分析聯(lián)合用藥對(duì)耐藥細(xì)胞活性的影響 采用CCK-8試劑盒分析EZH2抑制劑與吉非替尼對(duì)PC9/AB2細(xì)胞活性的影響：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔5×103細(xì)胞鋪于96孔板上，置于細(xì)胞孵箱中過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行加藥處理，處理時(shí)間為48 h。48 h后，取出96孔板，每孔加入20 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)37 ℃避光培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔的吸光值（450 nm）。取各個(gè)復(fù)孔的平均值，藥物抑制率計(jì)算公式：（未加藥組的吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值）/未加藥組吸光值×100%，最終得出GSK343及gefitinib的IC50濃度及抑制率曲線，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 EdU檢測(cè)DNA合成 EdU（5-ethynyl-2-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中，并能夠與Apollo?熒光染料發(fā)生特異性反應(yīng)，快速檢測(cè)細(xì)胞DNA合成。我們將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用胰酶消化轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)。按實(shí)驗(yàn)要求向96孔板的細(xì)胞進(jìn)行加藥處理，加藥處理后按照EdU試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同處理。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC9/AB2細(xì)胞鋪在6孔板上，放入37 ℃，5% CO2飽和度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)直至細(xì)胞長(zhǎng)至90%密度，用無(wú)菌的免酶槍頭在六孔板中央劃痕，用PBS清洗去除懸浮細(xì)胞，隨后按照實(shí)驗(yàn)要求加入不同處理組及陰性對(duì)照組，放入細(xì)胞孵箱培養(yǎng)，于0 h、16 h、32 h置于顯微鏡下觀察拍照。上述實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用不同藥物處理對(duì)數(shù)期的PC9/AB2細(xì)胞，處理時(shí)間為48 h。將提前處理好的4組細(xì)胞按照細(xì)胞1×104個(gè)鋪于上室并加入無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，混合液體總量為200 μL，于下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h。取出小室用棉簽小心拭去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，用結(jié)晶紫室溫染色25 min，并用PBS將多余染色液洗干凈，顯微鏡下觀察下室穿過(guò)的細(xì)胞，選取5個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，通過(guò)計(jì)算穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移能力。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)PC9/AB2凋亡的作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按細(xì)胞濃度5×106/孔，鋪于6孔板上，按照實(shí)驗(yàn)要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理。待處理后收集細(xì)胞，按照凋亡試劑盒的具體說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PI染色，隨后應(yīng)用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot, WB） 提取不同加藥處理的細(xì)胞蛋白，應(yīng)用PMSF（phenylmethanesulfonyl fluoride）+RIPA（radio immunoprecipitation assay）于冰上裂解30 min，BCA法測(cè)量蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白緩沖液混勻置于100 ℃金屬浴加熱變性。取30 μg變性后的蛋白上樣，80 V電泳2 h，120 V轉(zhuǎn)膜80 min，應(yīng)用5%脫脂牛奶/BSA封閉1 h。加入EZH2、EGFR、P-EGFR、Histone H3、H3K27me3、β-actin蛋白一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，次日用TBST清洗后，加入對(duì)應(yīng)二抗，顯色曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用graphpad prism 6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析作圖，實(shí)驗(yàn)中組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P值取雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。劃痕結(jié)果采用Image J 1.8.0版軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用EZH2抑制劑GSK343能夠顯著增強(qiáng)PC9/AB2細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性 對(duì)于單藥作用，我們應(yīng)用GSK343及吉非替尼處理細(xì)胞，各組藥物分別按濃度梯度0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L、128 μmol/L依次遞增，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔培養(yǎng)基液體為200 μL。應(yīng)用CCK-8分別檢測(cè)PC9及PC9/AB2對(duì)吉非替尼的敏感性。如圖1A所示，PC9的吉非替尼的IC50為2.73 μmol/L，而PC9/AB2 IC50=30.27 μmol/L，表明PC9/AB2對(duì)于吉非替尼耐藥性遠(yuǎn)超敏感型PC9細(xì)胞（P＜0.01）。PC9和PC9/AB2的GSK343的IC50分別為16.45 μmol/L和18.14 μmol/L，二者統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)有顯著差異（P=0.519）（圖1B）。

為了進(jìn)一步觀察加入EZH2抑制劑GSK343后PC9/AB2細(xì)胞對(duì)于吉非替尼的敏感性，我們將細(xì)胞分為兩組即：DMSO組（DMSO加藥量等于溶解GSK343藥物所需的DMSO量）與GSK343組（GSK343加藥量我們選取GSK343 1/2 IC50即9 μmol/L），分別采用不同濃度梯度吉非替尼：0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L、128 μmol/L處理PC9/AB2細(xì)胞。如圖1C所示，加入GSK343后吉非替尼的IC50為9.327 μmol/L，較DMSO組30.27 μmol/L明顯下降（P＜0.01），結(jié)果提示加入GSK343后PC9/AB2細(xì)胞對(duì)于吉非替尼的敏感性增加。

2.2 聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼能顯著抑制PC9/AB2細(xì)胞的活性和增殖 為了進(jìn)一步檢驗(yàn)聯(lián)合用藥對(duì)PC9/AB2耐藥細(xì)胞的作用效果，我們將實(shí)驗(yàn)處理組設(shè)定為4組即：NC組、GSK343組（9 μmol/L）、gefitinib組（15 μmol/L）、G+g組（9 μmol/L GSK343+15 μmol/L gefitinib），處理時(shí)間為48 h。如圖2A所示， CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與NC對(duì)照組比較，GSK343、gefitinib、G+g的細(xì)胞活性分別為（85.31±2.47）%、（69.03±5.93）%、（31.29±1.23）%，提示單用GSK343及gefitinib能夠抑制細(xì)胞的活性(P均＜0.01)，而聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥對(duì)耐藥細(xì)胞的抑制效果更明顯（P均＜0.01）。EdU結(jié)果顯示： GSK343組、gefitinib組及G+g組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為（45.02±2.47）%、（41.62±3.98）%、（1.75±2.06）%，明顯低于陰性對(duì)照組（NC）（52.03±3.87）%，P值分別為0.02、0.01、＜0.01，提示GSK343、gefitinib對(duì)于細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用，但兩藥合用對(duì)于細(xì)胞增殖抑制效果更為明顯（圖2B）。

2.3 聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼能顯著抑制PC9/AB2細(xì)胞的遷移 為了進(jìn)一步研究聯(lián)合用藥對(duì)耐藥細(xì)胞的遷移作用的影響，我們將實(shí)驗(yàn)分為4組：NC陰性對(duì)照組（含10%血清培養(yǎng)基）、GSK343組（8 μmol/L）、gefitinib組（15 μmol/L）及聯(lián)合用藥組（8 μmol/L GSK343+15 μmol/L gefitinib），通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)于耐藥細(xì)胞PC9/AB2的遷移能力的改變，分別以16 h及32 h為時(shí)間節(jié)點(diǎn)。如圖3A所示： 用藥16 h后，聯(lián)合應(yīng)用GSK343+gefitinib（劃痕寬度占比為74.59±1.58）較NC陰性對(duì)照組（29.18±2.88）能夠顯著地抑制劃痕愈合（P＜0.01），單用GSK343（51.36±8.58）也能夠?qū)τ诩?xì)胞遷移有一定的抑制作用（P＜0.01），而單用gefitinib（35.47±0.83）對(duì)于細(xì)胞的遷移能力影響較弱，但也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）；在用藥32 h后，NC對(duì)照組（1.22±1.17）劃痕已經(jīng)基本愈合，單用GSK343（19.6±1.51）或gefitinib（5.32±1.04）較NC對(duì)照組對(duì)細(xì)胞遷移有一定的抑制作用（P＜0.01,P=0.01），聯(lián)合應(yīng)用GSK343+gefitinib作用效果更為顯著（51.52±5.07,P＜0.01）。

圖1 應(yīng)用EZH2抑制劑GSK343能夠顯著增強(qiáng)PC9/AB2細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。A：PC9及PC9/AB2對(duì)不同濃度吉非替尼的細(xì)胞活性曲線；B：PC9及PC9/AB2對(duì)不同濃度GSK343的細(xì)胞活性曲線；C：聯(lián)合使用GSK343+吉非替尼能夠增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。Fig 1 EZH2 inhibitor GSK343 can significantly enhance the sensitivity to gefitinib of PC9/AB2 cells.A: Cell viability curves for PC9 and PC9/AB2 treated with different concentrations of gefitinib; B: Cell viability curves for PC9 and PC9/AB2 treated with different concentrations of GSK343; C:Combined use of GSK343+gefitinib can enhance the sensitivity to gefitinib of lung cancer cells.

隨后，我們分別將細(xì)胞分為4組進(jìn)行不同處理：NC組、GSK343組（9 μmol/L）、gefitinib組（15 μmol/L）、G+g組（9 μmol/L GSK343+15 μmol/L gefitinib），處理時(shí)間為48 h，將處理后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入Transwell小室中，觀察24 h細(xì)胞遷移至下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)，結(jié)果顯示：GSK343組、gefitinib和G+g組遷出的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為（279.33±8.14）、（352.33±13.65）、（66±14.93），較對(duì)照組（420±36.06）；GSK343、gefitinib對(duì)細(xì)胞的遷移均有一定抑制效果（P值分別為＜0.01、0.038）；G+g聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制細(xì)胞遷移（P＜0.01）。提示聯(lián)合應(yīng)用GSK343+gefitinib能夠顯著地抑制耐ge fitinib的PC9/AB2細(xì)胞的遷移能力（圖3B）。

2.4 聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼能顯著誘導(dǎo)PC9/AB2細(xì)胞的凋亡 如圖4所示，單獨(dú)使用GSK343=9 μmol/L處理48 h后細(xì)胞，凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例為（5.17±0.93）；單獨(dú)使用gefitinib=15 μmol/L，處理細(xì)胞48 h，凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例為（8.54±0.76）；聯(lián)合使用GSK343（9 μmol/L）+gefitinib（15 μmol/L），處理細(xì)胞48 h，凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例為（32.42±1.04）μmol/L，較NC陰性對(duì)照組（1.92±0.34）。GSK343及gefitinib對(duì)于耐藥細(xì)胞能夠產(chǎn)生一定的凋亡作用（P=0.01,P=0.00），但兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)效果更為顯著。

圖2 聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼能夠顯著抑制耐藥細(xì)胞的活性及增殖。A：CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性；B：EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖Fig 2 GSK343 combined with gefitinib significantly inhibited cell viability and proliferation in gefitinib-resistant cells.A: CCK-8 assays analysis the cell viability treated with GSK343+gefitinib; B: EdU assays analysis the cell proliferation treated with GSK343+gefitinib.

圖3 聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼能夠顯著抑制耐藥細(xì)胞的遷移能力。A：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；B：Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。Fig 3 GSK343 combining with gefitinib significantly inhibited the migration ability of gefitinib-resistant lung cancer cells.A:Wound healing assays analysis the cell migration treated with GSK343+gefitinib; B: Transwell chamber assays analysis the cell migration treated with GSK343+gefitinib.

圖4 聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼能夠顯著誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。Fig 4 GSK343 combining with gefitinib significantly induced apoptosis of gefitinib-resistant lung cancer cells.

圖5 聯(lián)合應(yīng)用GSK343+吉非替尼能夠顯著抑制EZH2、H3K27me3及P-EGFR的表達(dá)。Fig 5 GSK343 combining with gefitinib significantly inhibited the expression of EZH2, H3K27me3 and P-EGFR.

2.5 聯(lián)合應(yīng)用EZH2抑制劑GSK343+吉非替尼對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響 EGFR-TKIs類(lèi)藥物主要通過(guò)抑制EGFR磷酸化從而發(fā)揮作用，而EZH2抑制劑主要通過(guò)抑制組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化[Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27),H3K27me3]從而抑制下游靶基因的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用EZH2抑制劑GSK343+吉非替尼后，ezh2、P-EGFR及H3K27me3的蛋白表達(dá)水平較單藥組明顯降低，提示EZH2抑制劑GSK343聯(lián)合EGFR-TKI能夠顯著抑制PC9/AB2細(xì)胞EZH2、H3K27me3及EGFR磷酸化（圖5）。

3 討論

分子靶向治療給肺癌治療的帶來(lái)了一場(chǎng)革命性的變化[12]。與傳統(tǒng)的化療相比，EGFR-TKIs治療EGFR突變的晚期NSCLC具有效率更高，不良反應(yīng)更小，治療后的PFS更長(zhǎng)，已成為一線治療的首選[13,14]。EGFR基因突變具有多種類(lèi)型，且突變類(lèi)型與EGFR-TKIs的治療效果相關(guān)。85%-90%患者EGFR敏感性突變發(fā)生在19外顯子缺失或21外顯子點(diǎn)突變，這類(lèi)患者再應(yīng)用EGFR-TKIs治療能夠顯著延長(zhǎng)客觀緩解率（objective response rate, ORR）及PFS[15]。但應(yīng)用EGFR-TKIs治療會(huì)面臨一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題即絕大多數(shù)肺癌患者會(huì)在治療后1 年左右出現(xiàn)耐藥[16]。因此，開(kāi)發(fā)新型EGFR抑制劑、逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs獲得性耐藥、及延長(zhǎng)藥物的耐藥周期成為目前EGFR-TKIs研究領(lǐng)域的主要熱點(diǎn)。

隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)一些表觀遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)的復(fù)合物在NSCLC中也存在改變或者轉(zhuǎn)錄異常，比如EZH2[17]。EZH2已經(jīng)被證實(shí)在NSCLC中高表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)[18,19]。EZH2抑制劑能夠提升腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，增強(qiáng)藥物的療效：應(yīng)用EZH2抑制劑能夠有效地提升具有BRG1和EGFR突變的NSCLC細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性[20]；也有研究表明應(yīng)用EZH2抑制劑能夠通過(guò)PUMA基因從而逆轉(zhuǎn)NSCLC對(duì)于鉑類(lèi)化療藥物的耐藥性[21]。同時(shí)EZH2抑制劑也能夠顯著抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力，EZH2抑制劑能夠通過(guò)抑制NSCLC中的金屬蛋白酶組織抑制因子-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP-3）從而抑制癌細(xì)胞遷移[11,22]；也有研究證實(shí)EZH2抑制劑也能夠通過(guò)抑制核外調(diào)節(jié)蛋白talin的直接甲基化從而影響細(xì)胞粘附和遷移[23]。綜上所述，EZH2有可能成為NSCLC的治療新的靶點(diǎn)，同時(shí)EZH2抑制劑也有望給肺癌的治療帶來(lái)新的方向。

本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合應(yīng)用EZH2抑制劑GSK343與吉非替尼，結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著地抑制耐藥細(xì)胞的活性、增殖及遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且能夠增強(qiáng)EGFR-TKIs對(duì)于EGFR的磷酸化抑制效果。