微調(diào)可使CRISPR準(zhǔn)確度提高50倍

編譯 凌寒

CRISPR可能是首個(gè)有望顛覆天然基因組、消除遺傳疾病的基因編輯成果。但從一開(kāi)始，就有一道難題擺在面前：準(zhǔn)確性。

早在2017年，一份報(bào)告因使用CRISPR技術(shù)而充滿(mǎn)爭(zhēng)議：因?yàn)樵谛∈笊砩习l(fā)現(xiàn)了大量脫靶的編輯，基因編輯工具肆意地剪切了無(wú)辜的基因。這項(xiàng)研究遭到了強(qiáng)烈的駁斥，并最終被撤回，但人們對(duì)這種強(qiáng)大工具的脫靶問(wèn)題的擔(dān)憂(yōu)并沒(méi)有消失。即使相對(duì)準(zhǔn)確的CRISPR替代版本，最近也因?yàn)槠湓贒NA和RNA中引起數(shù)百個(gè)意想不到的突變而飽受爭(zhēng)議。

如果不能確保精準(zhǔn)性，任何已提出的CRISPR基因治療都將淪為“擲骰子”行為。

現(xiàn)在，來(lái)自杜克大學(xué)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)可能已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一個(gè)通用的解決方案：能從根本上提高幾乎所有形式的CRISPR準(zhǔn)確性——微調(diào)了向?qū)NA。向?qū)NA是CRISPR兩個(gè)組成中不可或缺的組分，發(fā)揮著類(lèi)似“偵探獵犬”的作用，它能在其合作伙伴Cas對(duì)特定DNA序列進(jìn)行切割前瞄準(zhǔn)好待修改的序列。該項(xiàng)研究于近期發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》雜志上。

如何微調(diào)？將一種“鎖定”結(jié)構(gòu)標(biāo)記到向?qū)NA的一端，這樣只有靶標(biāo)DNA才能激活Cas施展“剪刀”功能。然而，正是因?yàn)檫@個(gè)微調(diào)如此簡(jiǎn)單，向?qū)NA 2.0可以從根本上提高多個(gè)CRISPR系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，甚至高達(dá)200倍。這樣的微調(diào)，不僅對(duì)那些依賴(lài)經(jīng)典Cas9的系統(tǒng)有效，同樣也對(duì)依賴(lài)Cas12a及其他新型剪切系統(tǒng)有效。

這并不是增量調(diào)整。相反，這一調(diào)整策略與以往為提高CRISPR準(zhǔn)確度所作的努力截然不同，以往常致力于尋找新的、更好版本的Cas剪刀。

“我們所關(guān)注的解決方案，它不會(huì)增加更多的部件，而且能夠適用于任何一種CRISPR系統(tǒng)?！毖芯繄?bào)告的作者杜蘭·寇卡科（Dewran Kocak）說(shuō)。

“這是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的、簡(jiǎn)潔的、可以杜絕脫靶現(xiàn)象的解決方案。”第一作者查爾斯·格斯巴赫（Charles Gersbach）博士補(bǔ)充說(shuō)。

你好，我是向?qū)NA

為什么改變分子偵探獵犬能從根本上提高CRISPR編輯的準(zhǔn)確性？

回溯歷史，RNA結(jié)構(gòu)的變化所發(fā)揮的作用不容忽視。例如，榮獲了諾貝爾獎(jiǎng)的基因沉默技術(shù)（RNAi）花了數(shù)十年時(shí)間才得以揭示，對(duì)靶向RNA的微小調(diào)整可以大幅度減弱免疫應(yīng)答或提高效率和準(zhǔn)確性。

RNAi等來(lái)之不易的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)啟發(fā)著基因編輯。當(dāng)我們?cè)诿枋鯟RISPR的過(guò)程時(shí)，通常都是這么說(shuō)的：向?qū)NA——長(zhǎng)得像一條蠕蟲(chóng)似的——包含與靶標(biāo)DNA匹配的字母序列。當(dāng)這二者結(jié)合時(shí)，會(huì)遵循嚴(yán)格的配對(duì)規(guī)則，即A與T*結(jié)合，C與G結(jié)合，之后向?qū)NA將Cas剪刀拖過(guò)來(lái)，在預(yù)定的位置進(jìn)行DNA剪切。（*更準(zhǔn)確地說(shuō)， DNA中是“T”， RNA中是“U”。）

不幸的是，在生物學(xué)中，理論往往與現(xiàn)實(shí)不符。事實(shí)上，向?qū)NA看起來(lái)就像很多片被串在一起的三葉草葉子，里面塞滿(mǎn)了被稱(chēng)之為“莖環(huán)結(jié)構(gòu)”（stem-loops）的突起，這使得它的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合效率最大化?？偟膩?lái)說(shuō)，大多數(shù)向?qū)NA只包含20個(gè)左右的堿基。在人類(lèi)浩如煙海約60億個(gè)DNA堿基中，錯(cuò)配率相當(dāng)高。

這就是為什么設(shè)計(jì)向?qū)NA既是一門(mén)科學(xué)也是一門(mén)藝術(shù)的部分原因。與尤達(dá)的著名格言“要么做要么不做，沒(méi)有嘗試這一說(shuō)”不同，科學(xué)家們通常需要反復(fù)修改他們?cè)O(shè)計(jì)的特定向?qū)NA序列，才能使其正常工作。

盡管如此，CRISPR一直都有一本向?qū)NA工程設(shè)計(jì)指南——一種通用的原型設(shè)計(jì)，可適用于大多數(shù)的CRISPR應(yīng)用程序。

一切都與能量有關(guān)

研究小組的靈感來(lái)自于細(xì)胞需要能量。

正如任何其他生物事件一樣，向?qū)NA與DNA結(jié)合并釋放Cas是需要能量的。之前的研究發(fā)現(xiàn)，向?qū)NA與DNA匹配得越精確，兩者就越容易形成所謂的“R環(huán)”（一種啟動(dòng)了整個(gè)切割程序的分子雜交體）。

該團(tuán)隊(duì)的絕妙想法是在向?qū)NA的尾端添加一個(gè)額外的三葉草狀結(jié)構(gòu)。這種“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”（hairpin）在很多情況下就像一個(gè)實(shí)體塊，除非向?qū)NA與靶標(biāo)DNA匹配，否則它龐大的結(jié)構(gòu)就會(huì)阻止RNA與DNA配對(duì)形成R環(huán)。無(wú)法形成R環(huán)，就不會(huì)發(fā)生切割，就能保證非靶標(biāo)DNA序列的安全。但是，如果序列確實(shí)匹配的話(huà)，向?qū)NA就會(huì)與其相匹配的DNA形成R環(huán)，撕開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這反過(guò)來(lái)會(huì)激發(fā)Cas剪刀行動(dòng)。

該團(tuán)隊(duì)在計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的指導(dǎo)下，設(shè)計(jì)了一系列的攜帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的向?qū)NA或稱(chēng)“hp-sgRNAs”，在人類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行了試驗(yàn)。當(dāng)與經(jīng)典的Cas9配對(duì)時(shí)，新型分子偵探獵犬的靶標(biāo)特異性提升了大約50倍。在一項(xiàng)觀察細(xì)胞基因組中脫靶效應(yīng)的敏感實(shí)驗(yàn)中，研究小組發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典的向?qū)NA相比，他們的升級(jí)版本減少了124個(gè)脫靶位點(diǎn)，且沒(méi)有產(chǎn)生任何新的脫靶位點(diǎn)。

與它結(jié)合的Cas剪刀的效用一樣令人印象深刻，其中許多剪刀在結(jié)構(gòu)和功能上與Cas9僅有微弱的相似之處。然而，當(dāng)攜帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的向?qū)NA與Cas組合后，Cas12及其變體能夠切割指定的DNA序列，其效率與和普通向?qū)NA組合時(shí)不相上下，但脫靶的情況要少得多。

此外，研究小組還發(fā)現(xiàn)，他們能夠通過(guò)微調(diào)發(fā)夾的結(jié)構(gòu)來(lái)微調(diào)Cas剪刀的效能。一個(gè)“更緊湊”的發(fā)夾能夠使得鎖定更加牢固，這雖然會(huì)降低編輯效率，但也大大提高了準(zhǔn)確性。一個(gè)“寬松的”發(fā)夾結(jié)構(gòu)有助于保持Cas的活性，但對(duì)準(zhǔn)確性卻沒(méi)有什么幫助。

“通過(guò)觀察R環(huán)的形成，我們能夠預(yù)測(cè)發(fā)夾向?qū)NA的能量情況?！闭撐淖髡呓忉尩?。這種可預(yù)測(cè)性非常有價(jià)值——它能讓未來(lái)的科學(xué)家更簡(jiǎn)易地校正發(fā)夾向?qū)NA和CRISPR系統(tǒng)的強(qiáng)度與準(zhǔn)確性。

指南改變

這并不是科學(xué)家們第一次嘗試提高CRISPR的準(zhǔn)確性。

之前的一個(gè)想法是使CRISPR系統(tǒng)變成“鐵三角”：一個(gè)向?qū)NA加兩個(gè)Cas剪刀。要進(jìn)行DNA切割，兩個(gè)Cas必須都與相同的DNA序列相結(jié)合。雖然這是一個(gè)很巧妙的方法，但這個(gè)想法需要科學(xué)家們向細(xì)胞中輸入更多的成分，從而給本已很敏感的生態(tài)系統(tǒng)增加更多的不確定性。

另一個(gè)想法就是瓦解Cas剪刀，使他們不太可能亂剪，當(dāng)然這個(gè)想法也有其軟肋。設(shè)計(jì)特定性質(zhì)的蛋白質(zhì)是極其困難和耗時(shí)的，科學(xué)家必須根據(jù)他們的需要定制每個(gè)Cas變體。

格斯巴赫解釋說(shuō)：“每次我們發(fā)現(xiàn)一種新的CRISPR蛋白，都要進(jìn)行大規(guī)模的重新改造，使其更加精確，因此這并不是一個(gè)簡(jiǎn)易的解決方案?！?/p>

相比之下，杜克大學(xué)研究小組對(duì)向?qū)NA的探索，可能會(huì)從根本上改變今后CRISPR系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。

“所有CRISPR系統(tǒng)都有向?qū)NA，這些短RNA更容易設(shè)計(jì)。” 寇卡科說(shuō)道。

接下來(lái)，研究小組想進(jìn)一步確認(rèn)他們的發(fā)夾向?qū)NA替代品可以與其他已經(jīng)在使用的Cas剪刀協(xié)同工作。他們還想要深入研究這種合作關(guān)系是如何運(yùn)作的，并探索進(jìn)一步提高靶向準(zhǔn)確性的方法——不僅是在自由漂浮的細(xì)胞中，更重要的是，在患有遺傳疾病的動(dòng)物模型中。