穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞增殖、凋亡 及生物鐘的影響*

王曜暉，趙智權(quán)，杜運松，袁冰舒，王剛

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003）

穗花杉雙黃酮是卷柏中的一種多酚化合物[1]，具有降低血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗輻射及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[2-15]。肥胖與前脂肪細(xì)胞的過度分化、增生及脂肪細(xì)胞肥大密切相關(guān)[16]。肥胖機體出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，相關(guān)炎癥基因表達(dá)升高[17]。晝夜節(jié)律運動輸出周期故障蛋白（circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK）、腦及肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白的類似蛋白1（the brain and muscle arnt-like protein-1, BMAL1）的異常表達(dá)可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異 常[18-20]。本實驗將不同濃度的穗花杉雙黃酮作用于正常和過表達(dá)CLOCK的3T3-L1細(xì)胞后，觀察其對3T3-L1細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其與生物鐘基因的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

穗花杉雙黃酮（160523，純度＞98%）購自成都瑞芬恩科技有限公司，3T3-L1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，鼠抗CLOCK、兔抗BMAL1、兔抗Cleaved caspase-3及兔抗Bcl-2均購自美國Proteintech公司，抗鼠二抗、抗兔二抗及Click-iTTMEdU Alexa FluorTM555 Imaging Kit均購自美國Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑和RealMasterMix（SYBR Green）購自北京天根生物化學(xué)科技有限公司，正反向引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 主要儀器

CFX96 touch熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國Bio-Rad公司），Gallios流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物配制穗花杉雙黃酮用二甲基亞砜溶解，儲存濃度為10 g/L，0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们坝门囵B(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3.2 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)和分組3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5%二氧化碳CO2。穗花杉雙黃酮按0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及40.0 mg/L質(zhì)量濃度分成6組。

1.3.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖將3T3-L1細(xì)胞接種到96孔板中，200μl/孔細(xì)胞懸液，貼壁培養(yǎng)24 h，加入不同質(zhì)量濃度的穗花杉雙黃酮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以換液的方式加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，測定450 nm處的吸光度，參比波長600～650 nm。

1.3.4 實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, real-time RTPCR）檢測生物鐘基因的表達(dá)從0 h開始，每間隔4 h（共6次）提取3T3-L1細(xì)胞的總核糖核酸（RNA），并檢測培養(yǎng)箱中3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1的表達(dá)情況。見表1。

表1 real-time RT-PCR引物序列

將不同濃度穗花杉雙黃酮作用于3T3-L1細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用real-time RTPCR檢測其表達(dá)情況，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，57℃退火30 s，57℃延伸5 s，共循環(huán)40次。real-time RT-PCR結(jié)束后，計算CLOCK和BMAL1 mRNA與β-actin的相對表達(dá)量。

1.3.5 Western blotting檢測生物鐘蛋白的表達(dá)在 6孔板中種入細(xì)胞，24 h后觀察各孔細(xì)胞貼壁均勻，將不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮加入6孔板。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出置于冰上。吸去培養(yǎng)液，加入2 ml/孔預(yù)冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS），吸棄。加入200μl/孔預(yù)冷的RIPA裂解液，放置1 min后，用細(xì)胞刮將板底的細(xì)胞刮掉。將細(xì)胞懸浮液吸入1.5 ml離心管，置于冰上。每3 min震蕩15 s，重復(fù)5次。將離心管置于冷凍離心機中，12 000 r/min離心20 min，取上清凍存至-80℃冰箱，作為后續(xù)Western blotting的樣本。

將收取的蛋白樣品從-80℃取出，溶解后用酶標(biāo)儀檢測蛋白濃度。各組取等量的蛋白樣品混入6×Loading Buffer，加入適量的蛋白裂解液將體積補為20μl，混勻后于4℃?zhèn)溆谩Ｖ苽?%分離膠和5%濃縮膠，放于電泳槽，加入適量電泳液，拔出梳子后，按順序加入蛋白樣品。80 V恒壓30 min后，轉(zhuǎn)為120 V恒壓跑2 h。4℃轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST溶液溶解5%脫脂奶粉，將膜置于封閉液封閉1 h。按照抗體說明書建議濃度稀釋抗體，抗體稀釋液為0.5%脫脂奶粉。一抗室溫孵育4 h后，TBST洗3次，20 min/次。按抗體說明書稀釋二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次20 min。在膜上滴加適量的ECL發(fā)光檢測混合液后，拍照并分析。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況將不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用于3T3-L1細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用胰酶消化收集細(xì)胞，用冰冷的PBS調(diào)整待測細(xì)胞的濃度為5×105～1×106個/ml。取1ml細(xì)胞，4℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，再次使用冰冷的PBS懸浮細(xì)胞后，以同樣的條件進(jìn)行離心，棄上清液，每管加入100μl Binding buffer懸浮細(xì)胞。依次加入5 μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶，室溫避光條件下，繼續(xù)孵育5 min，加入Binding buffer至500 μl，輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀檢測0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及40.0 mg/L穗花杉雙黃酮對細(xì)胞凋亡的 影響。

1.3.7 EdU檢測細(xì)胞增殖20 mg/L穗花杉雙黃酮可以抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖，20 mg/L穗花杉雙黃酮引起CLOCK mRNA和蛋白表達(dá)降低。為證明穗花杉雙黃酮與CLOCK基因的相關(guān)性，將3T3-L1細(xì)胞分為3組：①藥物組：加入20 mg/L穗花杉雙黃酮；②聯(lián)合組：20 mg/L穗花杉雙黃酮處理3T3-L1細(xì)胞24 h后，過表達(dá)Pc-DNA-CLOCK質(zhì)粒；③對照組：未做任何處理。檢測3組細(xì)胞24 h時的增殖情況。將細(xì)胞消化并接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)量為5×104個/孔。培養(yǎng)24 h后，將配好的EdU溶液（20μmol/L）分別加入各孔，100μl/孔，孵育4 h。將96孔板取出，吸棄液體，0.01 mmol/L PBS清洗2遍后，加入4%多聚甲醛固定4 h。室溫0.01 mol/L PBS清洗2次后，用1% TritonX-100處理1 h，加入染色液室溫處理1 h。吸棄染色液后用0.01 mol/L PBS清洗2次，用DAPI進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察染色 情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1的周期性表達(dá)

不同時間點3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1 RNA的相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各相鄰組間進(jìn)一步兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），0、12及18 h表達(dá)量較為接近，從中選取18 h進(jìn)行后續(xù)實驗。見表2和圖1。

表2 生物鐘基因mRNA相對表達(dá)量（×10-3，±s）

表2 生物鐘基因mRNA相對表達(dá)量（×10-3，±s）

時間點CLOCK mRNABMAL1 mRNA 0 h0.605±0.0030.621±0.002 4 h0.675±0.0010.784±0.003 8 h1.011±0.0040.953±0.003 12 h1.423±0.0051.430±0.003 16 h1.193±0.0041.331±0.003 18 h1.114±0.0031.124±0.013 20 h1.025±0.0031.130±0.004 F值92.69893.745 P值0.0000.000

2.2 穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞增殖的影響

不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時的3T3-L1細(xì)胞活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=194.485，P=0.000）；與0.0 mg/L比較，2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞增殖無影響（P＞0.05），20和40 mg/L穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用（P＜0.05）。見表3和圖2。

圖1 不同時間點3T3-L1細(xì)胞BMAL1和CLOCK mRNA的表達(dá)變化

表3 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時的3T3-L1細(xì)胞 活性比較（%，±s）

表3 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時的3T3-L1細(xì)胞 活性比較（%，±s）

注：?與0.0 mg/L比較，P ＜0.05

藥物質(zhì)量濃度細(xì)胞相對活性0.0 mg/L103.17±5.683 2.5 mg/L107.72±2.725 5.0 mg/L108.768±4.040 10.0 mg/L108.664±4.631 20.0 mg/L94.599±1.991?40.0 mg/L69.931±1.0678?F值194.485 P值0.000

圖2 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞活性的影響（±s）

2.3 穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響

各組早期凋亡率、總凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與0.0 mg/L組比較，2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞總凋亡率無影響（P＞0.05），20.0和40.0 mg/L穗花杉雙黃酮促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。見表4。

2.4 穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時，3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3和Bcl-2比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與0.0 mg/L 比較，2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮不影響3T3-L1細(xì)胞中Cleaved caspase-3的表達(dá)（P＞0.05），20和40 mg/L穗花杉雙黃酮促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞中Cleaved-caspase-3的表達(dá)（P＜0.05）；與0.0 mg/L比較，2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮不影響3T3-L1細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)（P＞0.05），20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制Bcl-2的表達(dá)（P＜0.05）。見表5和圖3。

表4 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

表4 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響（%，±s）

注：?與0.0 mg/L比較，P ＜0.05

藥物濃度早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率0.0 mg/L3.89±1.651.24±0.975.2±2.55 2.5 mg/L3.64±1.731.52±0.645.5±3.03 5.0 mg/L4.02±0.791.26±1.324.91±0.96 10.0 mg/L4.73±1.252.1±0.685.19±3.57 20.0 mg/L8.37±1.933.32±2.1211.24±4.5?40.0 mg/L19.34±2.363.26±1.2323.44±2.75?F值39.4593.26324.009 P值0.0000.4300.000

表5 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響（±s）

表5 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響（±s）

注：?與0.0 mg/L比較，P ＜0.05

藥物質(zhì)量濃度Cleaved caspase-3Bcl-2 0.0 mg/L1.013±0.1691.066±0.171 2.5 mg/L1.025±0.1891.013±0.172 5.0 mg/L1.037±0.1531.084±0.135 10.0 mg/L1.022±0.1551.032±0.133 20.0 mg/L1.533±0.162?0.693±0.129?40.0 mg/L1.723±0.147?0.512±0.125?F值20.39315.057 P值0.0000.000

圖3 穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響（±s）

2.5 穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1 mRNA的影響

不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時，3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1 mRNA相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與0.0 mg/L比較，2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞18 h時CLOCK mRNA的轉(zhuǎn)錄無影響（P＞0.05），20和40 mg/L 抑制CLOCK mRNA的轉(zhuǎn)錄（P＜0.05）；與0.0 mg/L比較，2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞18 h BMAL1 mRNA的轉(zhuǎn)錄無影響（P＞0.05），20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制3T3-L1細(xì)胞BMAL1 mRNA的轉(zhuǎn)錄（P＜0.05）。見表6和圖4。

表6 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時3T3-L1 BMAL1和CLOCK mRNA相對表達(dá)量比較（×10-3，±s）

表6 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時3T3-L1 BMAL1和CLOCK mRNA相對表達(dá)量比較（×10-3，±s）

注：?與0.0 mg/L比較，P ＜0.05

藥物濃度CLOCK mRNABMAL1 mRNA 0.0 mg/L0.572±0.0440.723±0.010 2.5 mg/L0.575±0.0230.721±0.011 5.0 mg/L0.594±0.0250.718±0.011 10.0 mg/L0.570±0.0160.720±0.012 20.0 mg/L0.405±0.017?0.591±0.008?40.0 mg/L0.343±0.017?0.513±0.005?F值34.888255.412 P值0.0000.000

圖4 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對BMAL1和CLOCK mRNA的影響（±s）

2.6 穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1蛋白的影響

不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時，3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗，與0.0 mg/L比較，2.5、5.0及10.0 mg/L 穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞的18 h時CLOCK蛋白的表達(dá)無影響（P＞0.05），20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制CLOCK蛋白的表達(dá)（P＜0.05）；與0.0 mg/L比較，2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對3T3-L1細(xì)胞18 h時BMAL1蛋白的表達(dá)無影響（P＞0.05），20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制BMAL1蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。見表7和圖5。

表7 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮處理后CLOCK 和BMAL1蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表7 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮處理后CLOCK 和BMAL1蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

注：?與0.0 mg/L比較，P ＜0.05

藥物濃度CLOCK蛋白BMAL1蛋白0.0 mg/L1.053± 0.1670.953±0.035 2.5 mg/L1.173±0.2011.033±0.110 5.0 mg/L1.116±0.1101.043±0.093 10.0 mg/L1.114±0.1291.097±0.172 20.0 mg/L0.551±0.088?0.723±0.040?40.0 mg/L0.447±0.049?0.547±0.050?F值17.38915.219 P值0.0000.000

圖5 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮處理后BMAL1和CLOCK蛋白的表達(dá)變化（±s）

2.7 CLOCK基因?qū)λ牖ㄉ茧p黃酮抑制3T3-L1細(xì)胞增殖的影響

藥物組、聯(lián)合組、對照組3T3-L1細(xì)胞增殖情況和CLOCK蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，聯(lián)合組EdU陽性細(xì)胞率和CLOCK蛋白相對表達(dá)量高于藥物組（P＜0.05），但低于對照組（P＜0.05）。見表8和圖6～8。

表8 不同處理對3T3-L1細(xì)胞增殖和CLOCK蛋白表達(dá)的影響（±s）

表8 不同處理對3T3-L1細(xì)胞增殖和CLOCK蛋白表達(dá)的影響（±s）

組別Edu陽性細(xì)胞率/%CLOCK對照組56.333±1.5280.984±0.127藥物組19.333±2.0820.459±0.074聯(lián)合組39.667±2.5170.734±0.065 F值237.71836.151 P值0.0000.000

圖6 各組3T3-L1細(xì)胞增殖情況

圖7 3組EdU陽性細(xì)胞率比較（±s）

圖8 3組3T3-L1細(xì)胞CLOCK蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

3 討論

24 h生物節(jié)律被稱作晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律的形成與生物鐘系統(tǒng)的表達(dá)密切相關(guān)[21]。現(xiàn)已知的生物鐘基因主要有9種，在下丘腦視交叉上核的作用下，調(diào)節(jié)生物體的節(jié)律性活動。BMAL1基因處于生物鐘體系的上游，其轉(zhuǎn)錄翻譯后的蛋白產(chǎn)物是正反饋環(huán)路中的調(diào)節(jié)因子，并與CLOCK蛋白結(jié)合形成異二聚體，這些正性成分啟動后經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯生成相應(yīng)的蛋白。同時PER和CRY等負(fù)性成分表達(dá)，阻止正性成分的表達(dá)和功能，形成完整的反饋通路。

在離體3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)即使脫離機體中樞SCN生物鐘的影響，脫離周期性的日光照射，離體3T3-L1細(xì)胞在無光照的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，其生物鐘基因CLOCK和BMAL1仍然呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律的周期性表達(dá)，其表達(dá)呈午時偏高，而凌晨和夜晚偏低的節(jié)律，這與TODA等[22]在離體情況所做的NIH3T3中相關(guān)基因的節(jié)律性表達(dá)相近似，也從側(cè)面證實生物鐘基因節(jié)律的形成可能與地球自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn) 有關(guān)。

肥胖及其并發(fā)癥在全球范圍內(nèi)廣泛存在，其誘因相對復(fù)雜，主要由代謝異常引起。有資料顯示，肥胖癥的發(fā)生與倒班等晝夜節(jié)律異常有關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1基因在脂質(zhì)代謝、糖平衡和能量代謝中也有十分重要的作用。與此同時，BMAL1與CLOCK組成的異二聚體在調(diào)節(jié)葡萄糖的動態(tài)平衡和胰島素抵抗中意義重大。研究表明，BMAL1和/或CLOCK基因異常的小鼠表現(xiàn)出肥胖或體脂減少等癥狀，這些都表明BMAL1、CLOCK基因與肥胖密切相關(guān)。

穗花杉雙黃酮有降血糖和抗氧化等作用[2]，在抑制肥胖的發(fā)生中有十分重要的潛在藥用價值。穗花杉雙黃酮能否影響3T3-L1細(xì)胞中生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而影響細(xì)胞的增殖和凋亡，尚未有明確的 結(jié)論。

細(xì)胞是生物體的基本組成部分，3T3-L1作為脂肪前體細(xì)胞在生物體脂肪細(xì)胞的形成及肥胖的發(fā)生過程中都有著十分重要的作用。穗花杉雙黃酮在較低濃度時對3T3-L1細(xì)胞的增殖和凋亡影響不大，高濃度時抑制其增殖而促進(jìn)其凋亡。Cleaved caspase-3是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成員，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起重要作用，而Bcl-2通過結(jié)合Bax抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，高濃度穗花杉雙黃酮通過上調(diào)Cleaved caspase-3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。這提示穗花杉雙黃酮可能成為潛在的抑制肥胖發(fā)生的藥物，但有待于在整體動物和臨床試驗中進(jìn)一步驗證。

通過檢測不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對生物鐘基因CLOCK、BMAL1 mRNA和蛋白的影響發(fā)現(xiàn)，其mRNA和蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，同時穗花杉雙黃酮處理后，過表達(dá)CLOCK基因使被抑制的3T3-L1細(xì)胞增殖率得到一定恢復(fù)，這提示穗花杉雙黃酮對3T3-L1增殖和凋亡的影響與生物鐘基因的表達(dá)有關(guān)。