載基因磁性脂質(zhì)微泡的制備及對人HepG2細胞的生長抑制作用研究*

李華梅，景香香，劉元稅

（海南省人民醫(yī)院，海南 ?？?570311）

近年來，隨著醫(yī)學分子影像學的發(fā)展，靶向超聲 微泡在超聲分子顯像及治療中的研究和應(yīng)用愈來愈受到學者們的廣泛關(guān)注。本研究在脂質(zhì)微泡中負載磁靶向納米粒子并攜帶基因，研制出一種新型的載基因磁性脂質(zhì)微泡，這樣既可以在外加磁場的作用下實現(xiàn)基因的靶向高效定位釋放，又可以利用磁性粒子的磁感應(yīng)升溫特性對腫瘤細胞進行熱療，為今后實現(xiàn)該磁性脂質(zhì)微泡用于腫瘤的聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水、PEI、DSPC、DPPE（美國Sigma公司），SF6氣體、吐溫80、甘油、丙二醇、pEGFP-C1（4.7 kb）、Fe3O4磁性納米粒子（海南省人民醫(yī)院中心實驗室制備并儲存），PLXSN質(zhì)粒、Ecoli DH5Q和人肝癌細胞系HepG2（海南省人民醫(yī)院中心實驗室儲存）。

1.2 儀器

能譜儀（Thermo NORAN,vantage,美國），機械振蕩儀（重慶影像研究所），SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備（深圳雙平高頻加熱器廠），掃描電鏡（日本JEOL JsM-6360LV），流式細胞儀（FACS vantage SE 型,美國Becton-Dickson制造），激光粒度分析儀（英國MALVERN公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 載基因磁性脂質(zhì)微泡的制備將 3 種有機磷脂按一定比例充分溶解于有機溶劑中，加熱30 min使有機溶劑蒸發(fā)完全，將葡萄糖和丙二醇按比例配置的水合液加入西林瓶中，超聲分散后使其形成脂質(zhì)懸液。在此懸液里先加入一定量的PEG4000和吐溫800.01 ml后，將一定量DNA/PEI/Fe3O4和明膠按比例加入到脂質(zhì)懸液中，用注射器充入定量的SF6氣體置換西林瓶上方的空氣。將西林瓶放入機械振蕩器中振蕩60 s，即得載基因磁性脂質(zhì)微泡。

1.3.2 磁性脂質(zhì)微泡體外升溫實驗以 PBS 溶液配制出Fe3O4濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 g/L等4種磁性脂質(zhì)微泡溶液，各取5 ml入平底試管（20 mm）中，以20℃為起始溫度，置于輸出電流30 A、頻率230 kHz的SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備加熱1 h。每5 min測1次溫度，以時間為橫坐標、溫度為縱坐標繪制磁性脂質(zhì)微泡的升溫曲線[1]。

1.3.3 轉(zhuǎn)染效率的觀察轉(zhuǎn)染之前，預先將質(zhì)粒 DNA和PEI-Fe3O4分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，然后按每孔中加入4 μg質(zhì)粒DNA的量，按照磁性納米粒子與質(zhì)粒DNA的比率（固定質(zhì)粒DNA的質(zhì)量）分別加入不同量的 PEI-Fe3O4（15 g/L），最后總體積為 400 μl。接著，將復合物置于室溫下孵育30 min，將此混合物加入脂質(zhì)原溶液中搖振，制備出載基因磁性脂質(zhì)微泡。將HepG2細胞接種于6孔板中，5×105個/孔細胞，孵育18 h后，用2 ml無血清1640培養(yǎng)基替換原來的細胞培養(yǎng)基，其中含有按照不同比率配制的500 μl PEI-Fe3O4/pEGFP載基因磁性脂質(zhì)微泡（A組），置于強磁鐵上30 min，然后，用新鮮的含有血清的培養(yǎng)基替換無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。以裸DNA（B組）和明場圖（C組）作為轉(zhuǎn)染的對照。熒光顯微鏡下觀察細胞熒光蛋白的表達情況。

1.3.4 載基因磁性脂質(zhì)微泡基因治療聯(lián)合磁流體熱療對HepG2細胞生長的影響MTT方法測定細胞增殖率，取對數(shù)生長期HepG2細胞并吹打成細胞懸液，細胞濃度調(diào)整為4×104個/ml，按每孔100 ml接種于96孔板，每組5個接種復孔，接種細胞24 h后，隨機分為4組，1組加入1640培養(yǎng)液，2組加入磁性脂質(zhì)微泡，3、4組加入載基因磁性脂質(zhì)微泡，其中2、4組聯(lián)合MFH板置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上1 h，給定輸出電流30 A，交變磁場為4 kW，兩板置于飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，每孔加入 MTT 20 pl，以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入溶液150 μl DMSO/孔，搖勻10 min。讀取酶標儀上493 nm處光密度（OD）值，取得細胞增殖率[2]。各組細胞存活率計算公式：實驗組OD均值/對照組OD均值×100%）。

流式細胞儀的測定，取對數(shù)生長期的HepG2細胞吹打成細胞懸液，將其濃度調(diào)整為3×105個/ml后接種于培養(yǎng)瓶。4個實驗組共接種4個培養(yǎng)瓶，24 h后按分組情況分別加入1640培養(yǎng)液（1組）、磁性脂質(zhì)微泡（2組）、載基因磁性脂質(zhì)微泡（3組）、載基因磁性脂質(zhì)微泡（4組），其中2、4組置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上1 h，給定交變磁場4 kW，輸出電流30 h，4瓶細胞置于飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。檢測前將 PBS 洗滌 2 次的細胞重懸于 0.5 ml PI染色液（20 mg/ml，0.25 mg/ml RNase A）中于室溫下避光染色30 min，用目絲網(wǎng)過濾后上機分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗和χ2分割法，χ2分割法檢驗水準為α=0.0083，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 磁性脂質(zhì)微泡造影劑的表征

所制磁性脂質(zhì)微泡掃描電鏡下似圓球形，平均粒徑為1 127 nm，分散度好（見圖1）。表面能譜分析示磁性脂質(zhì)微泡中P為脂質(zhì)成分，F(xiàn)e、O為磁性材料的成分（見圖2）[1]。

圖1 磁性脂質(zhì)微泡掃描電鏡圖

圖2 磁性脂質(zhì)微泡的能譜分析

2.2 磁性脂質(zhì)微泡體外升溫實驗結(jié)果

磁場強度恒定條件下，磁性脂質(zhì)微泡升溫能力與Fe3O4磁性納米粒子濃度呈正相關(guān)，但有共同規(guī)律：前30 min升溫快速，30～ 50 min升溫平緩，50 min 后恒定于42～62℃（見圖3）。

圖3 不同濃度Fe3O4磁性脂質(zhì)微泡磁感應(yīng)升溫曲線

2.3 轉(zhuǎn)染效率

pEGFP-C1/PEI/Fe3O4載基因磁性脂質(zhì)微泡轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達（見圖4）。

圖4 熒光顯微鏡下HepG2轉(zhuǎn)染效率的觀察 （×200）

2.4 載基因磁性脂質(zhì)微泡基因治療聯(lián)合磁流體熱療對HepG2細胞生長的影響

2.4.1 MTT實驗結(jié)果 各組 HepG2 細胞相對增殖率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=16.481，P=0.001）。2、3、4組對肝癌細胞HepG2增殖均有抑制作用，且4組對HepG2細胞增殖的抑制作用高于2、3組。見圖5。

圖5 載Wtp53基因磁性脂質(zhì)微泡對HepG2的生長抑制作用

2.4.2 流式細胞儀檢測結(jié)果各組 HepG2 細胞經(jīng)處理48 h后，流式細胞術(shù)分析顯示：2、3、4組在細胞周期G0期前細胞周期均被不同程度地阻滯在S或G/M期，且出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。1組凋亡率為0.28%，2組凋亡率為16.13%，3組凋亡率為20.05%，4組凋亡率為42.93%，各組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=46.835，P=0.000），2組與3組凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.0083），2組與4組、3組與4組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0083）。見圖6。

圖6 載Wtp53基因磁性脂質(zhì)微泡處理細胞后的流式細胞圖

3 討論

超聲微泡經(jīng)歷了從普通微泡到靶向微泡的發(fā)展階段，現(xiàn)階段，在磁性脂質(zhì)微泡的表面進行修飾[3]或在其內(nèi)部進行負載，使其成為藥物和基因的靶向載體，制備出兼具靶向診斷和治療的磁性脂質(zhì)微泡成為研究熱點。

超聲微泡用于包裹氣體的殼膜材料主要是體內(nèi)可生物降解的高分子多聚物[4-5]、脂質(zhì)[6]或白蛋白[7]，為了便于微泡攜帶更多抗體和多肽等配體[8-9]，可通過調(diào)節(jié)殼膜材料的脂質(zhì)配比或是適當配比輔料來對微泡表面進行修飾。超聲微泡的氣體核心多采用氟碳氣體（如C6F）或氟硫氣體（如SF6），其優(yōu)點為彌散度低、血液溶解度低。本室成膜材料選擇有機合成磷脂，膜內(nèi)填充SF6氣體，采用機械振蕩法制備磁性脂質(zhì)微泡，經(jīng)反復驗證，確定振蕩頻率為4 500 r/min，即可使微泡粒徑＜2 μm，能經(jīng)血液循環(huán)順利到達病變部位，不易導致肺栓塞。

超聲微泡不僅用于制備影像增強劑來提高圖像對比度，同時也可作為靶向基因載體來攜載基因。為了賦予普通微泡磁靶向性和磁感應(yīng)升溫特性且又可作為基因載體，筆者采用一定技術(shù)將進行表面修飾的磁性納米粒與PLSN-53質(zhì)粒結(jié)合后混入脂質(zhì)原溶液中一起搖振，即制備出載基因磁性脂質(zhì)微泡。

研究者將磁性脂質(zhì)微泡作為一種安全、便捷的載體[10-11]，其表面或內(nèi)部攜載的基因或藥物能夠靶向釋放，從而達到治療疾病的目的?；虻挠行мD(zhuǎn)染是基因治療成功的關(guān)鍵。HALLOW等[12]的研究表明，微泡作為一種空化核，在超聲輻照下可產(chǎn)生瞬時空化，升高局部組織和毛細血管細胞膜的通透性，促成聲孔形成。另外有學者研究亦表明[13]，超聲作用微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)使其攜載的藥物和基因得到高效利用，達到良好的靶向治療效果。SAKAKIMA等[14]研究發(fā)現(xiàn)，超聲輻射聯(lián)合磁性脂質(zhì)微泡轉(zhuǎn)染細胞可使轉(zhuǎn)染效率提高近6倍。LENTACKER等[15]制作的攜帶質(zhì)粒DNA微泡可提高人肝癌細胞轉(zhuǎn)染效率，明顯抑制肝癌細胞的生長。QIU等[16]利用超聲輻照下，微泡聲空化效應(yīng)介導EGFP基因轉(zhuǎn)染兔肌腱，結(jié)果證實EGFP基因在兔肌腱中得到持續(xù)高表達。

本研究創(chuàng)新性地將具有高熱穩(wěn)定性、良好的水溶性和較大的生物相容性的磁性納米粒子引入超聲微泡，旨在賦予普通微泡磁靶向性的同時，使微泡對腫瘤組織兼具基因治療和磁感應(yīng)熱療[17]的特性。本實驗交變磁場中包有磁性納米粒的脂質(zhì)微泡懸浮液溫度上升后穩(wěn)定在42～62℃，該區(qū)間溫度對腫瘤熱療具有良好效果。因此，可以利用不同濃度磁性脂質(zhì)微泡在一定磁場下的升溫恒溫來實現(xiàn)對腫瘤的熱療[1]。

本研究制備的磁性脂質(zhì)微泡不僅具有磁場的靶向性，同時可作為一種新型的磁流體和基因的載體，對腫瘤進行磁感應(yīng)熱療和基因治療，有望成為靶向腫瘤治療的新途徑。