動植物中DNA甲基化的研究進(jìn)展

曹婷婷 何航

摘 要 DNA甲基化是將DNA基團(tuán)加入DNA分子的過程，作為一種重要的非永久性但相對長期可遺傳的基因修飾，在維持細(xì)胞正常的轉(zhuǎn)錄活性、DNA 損傷修復(fù)能力以及在遺傳印記、胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都有不可替代的作用，是分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文總結(jié)了近年來對DNA甲基化的相關(guān)研究，歸納了DNA甲基化的保守功能、在動植物中甲基化研究、在疾病中的甲基化研究和DNA甲基化的應(yīng)用，以期對DNA 甲基化這一表觀遺傳學(xué)熱點(diǎn)進(jìn)行深入的學(xué)習(xí)探討。

關(guān)鍵詞 DNA；甲基化；基因修飾

1 引言

DNA甲基化是指將DNA基團(tuán)加入到DNA分子的過程，這一過程可以在不改變序列的情況下改變DNA片段的活性，當(dāng)其位于基因啟動子中時，常可以抑制基因轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化與基因組印記，X染色體失活，轉(zhuǎn)座因子的抑制、衰老和癌發(fā)生等正常發(fā)育中的關(guān)鍵過程密切相關(guān)，因此被認(rèn)為非常重要。

胞嘧啶和腺嘌呤等兩個堿基可被甲基化。胞嘧啶甲基化廣泛存在于真核生物和原核生物之中，其甲基比化率有很大的物種差異，其中14%的胞嘧啶在擬南芥中甲基化；8%在絨泡菌；4%在家鼠；2.3%在大腸桿菌中。在植物中，近來發(fā)現(xiàn)的數(shù)量和種類也逐漸增多，DNA甲基化及其許多DNA甲基轉(zhuǎn)移酶被認(rèn)為是從原始RNA甲基化發(fā)展而來。

2 動植物體中的甲基化

2.1 動物體中的甲基化

DNA甲基化模式在哺乳動物親子傳遞時幾乎被消除，而后再重建，即父母已形成的甲基化不會傳遞到子代，而是在配子形成及胚胎早期發(fā)生中兩次發(fā)生去甲基化和重新甲基化的過程。在最初的受精卵，以及桑椹胚和囊胚的開始幾個分裂周期中發(fā)生去甲基化，而后在植入胚胎時產(chǎn)生甲基化波動，其中CpG島被保護(hù)免于甲基化。由此可表現(xiàn)為全局抑制，僅允許管家基因廣泛表達(dá)。胚胎植入后期，甲基化模式具有階段性和組織特異性等特點(diǎn)，因此，每個單獨(dú)的細(xì)胞類型在長時間內(nèi)穩(wěn)定持續(xù)[1]。

盡管DNA甲基化本身對于轉(zhuǎn)錄沉默本身不是必需的，但是仍將其當(dāng)做是轉(zhuǎn)錄絕對失活的狀態(tài)的鎖定特征。尤其在基因組印記和X染色體失活的背景下，DNA甲基化在沉默單等位基因時起到關(guān)鍵作用[2]。表達(dá)和沉默等位基因的甲基化狀態(tài)不同，DNA甲基化的喪失是導(dǎo)致Xist在體細(xì)胞中的印記和重新表達(dá)的原因。胚胎發(fā)育時期，幾乎沒有基因改變其甲基化狀態(tài)，而在種系中特異性表達(dá)的許多基因例外。由于三種中任一種感受態(tài)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶被敲除均會發(fā)生死胎或產(chǎn)后死亡的情況，由此可知DNA甲基化在細(xì)胞分化時是必需的。而在胚囊的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞這類未分化細(xì)胞中，DNA甲基化則并不必需。另外，DNA甲基化僅調(diào)節(jié)一部分基因，因此，其缺失是否準(zhǔn)確致使分化細(xì)胞死亡尚需進(jìn)一步研究。

由于基因組印記的現(xiàn)象，母本和父本基因組被差異標(biāo)記，并且必須在每次生殖細(xì)胞形成時進(jìn)行重新編輯，即根據(jù)其所傳遞親本的性別刪除、重建原有的甲基化模式。配子形成后，除與印跡基因相關(guān)的區(qū)域，親代DNA將重復(fù)去甲基化和再甲基化過程。這一過程是形成胚胎全能性和消除表觀遺傳變化的關(guān)鍵因素[2]。

2.2 植物體中的甲基化

植物體中的甲基化在理解模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的DNA甲基化方面取得了重大進(jìn)展。植物中的DNA甲基化不同于哺乳動物，哺乳動物中的DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點(diǎn)的胞嘧啶核苷酸上，在植物中胞嘧啶可在CpG，CpHpG和CpHpH位點(diǎn)甲基化，其中H代表任何核苷酸但不代表鳥嘌呤。總體而言，擬南芥 DNA是高度甲基化的，質(zhì)譜分析估計有14%的胞嘧啶被修飾。將甲基轉(zhuǎn)移并共價連接到DNA上的主要擬南芥 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DRM2，MET1和CMT3。DRM2和MET1蛋白分別與哺乳動物甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3和DNMT1具有顯著的同源性，而CMT3蛋白是植物界獨(dú)有的。目前有兩類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶：

（1）從頭類，或在DNA上產(chǎn)生新的甲基化標(biāo)記的酶；（2）維持類別，其識別DNA親本鏈上的甲基化標(biāo)記，并在DNA復(fù)制后將新甲基化轉(zhuǎn)移至子鏈。

DRM2是唯一被認(rèn)為是從頭的酶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。還顯示DRM2與MET1和CMT3一起參與通過DNA復(fù)制維持甲基化標(biāo)記[3]。目前尚不清楚細(xì)胞如何確定從頭DNA甲基化的位置，但有證據(jù)表明，對于許多（盡管不是全部）位置，涉及RNA指導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）。在RdDM中，特定RNA轉(zhuǎn)錄物由基因組DNA模板產(chǎn)生，并且該RNA形成稱為雙鏈RNA分子的二級結(jié)構(gòu)。雙鏈RNA通過小干擾RNA（siRNA）或microRNA（miRNA）途徑指導(dǎo)產(chǎn)生RNA的原始基因組位置的從頭DNA甲基化。這種機(jī)制被認(rèn)為在細(xì)胞防御 RNA病毒和或細(xì)胞防御中很重要轉(zhuǎn)座子，這兩種轉(zhuǎn)座子通常形成可以對宿主基因組具有誘變性的雙鏈RNA。通過甲基化它們的基因組位置，通過一種目前尚不清楚的機(jī)制，它們被關(guān)閉并且不再在細(xì)胞中活躍，保護(hù)基因組免受其誘變效應(yīng)。

3 動物疾病中的甲基化

3.1 癌癥中的甲基化

在癌癥等多種疾病病程中，CpG島（基因啟動子）的過甲基化會沉默轉(zhuǎn)錄并通過分裂遺傳至子細(xì)胞。目前，許多人認(rèn)為在癌癥發(fā)生發(fā)展中DNA甲基化是分成重要的一環(huán)。通常情況下，由于存在染色體具不穩(wěn)定和印記丟失的情況，導(dǎo)致較早出現(xiàn)低甲基化，另外，基因沉默，如致癌基因抑制因子，則會影響與啟動子有關(guān)的高甲基化，這是表觀遺傳治療的可能的靶標(biāo)[4]。在癌癥病程中有數(shù)以百計的基因會被激活或者沉默，除基因突變外，大部本分基因的沉默由DNA甲基化狀態(tài)的改變所致。DNA甲基化引起癌癥沉默通常發(fā)生在多個CpG位點(diǎn)在CpG島存在于所述啟動子的蛋白質(zhì)編碼基因。micRNA表達(dá)的變化也是癌癥中激活和沉默基因的原因，改變的micRNA表達(dá)通過控制micRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子中CpG島中CpG位點(diǎn)的超低甲基化而發(fā)生。

3.2

諸如DNA甲基化的表觀遺傳修飾已涉及心血管疾病，包括動脈粥樣硬化。在動脈粥樣硬化的動物模型中，血管組織以及諸如單核血細(xì)胞的血細(xì)胞表現(xiàn)出具有基因特異性高甲基化區(qū)域的整體低甲基化。DNA甲基化多態(tài)性可以用作動脈粥樣硬化的早期生物標(biāo)志物，因為它們在觀察到病變之前存在，這可以提供檢測和風(fēng)險預(yù)防的早期工具。

靶向DNA甲基化多態(tài)性的兩種細(xì)胞類型是單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，其經(jīng)歷總體低甲基化。這種全球性低甲基化背后提出的機(jī)制之一是同型半胱氨酸水平升高導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，這是已知的心血管疾病危險因素。同型半胱氨酸的高血漿水平抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其導(dǎo)致低甲基化。DNA的低甲基化影響改變平滑肌細(xì)胞增殖，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和增加炎癥介質(zhì)的基因，所有這些都是形成動脈粥樣硬化病變的關(guān)鍵。高水平的同型半胱氨酸也導(dǎo)致雌激素受體啟動子區(qū)CpG島的高甲基化α（ERα）基因?qū)е缕湎抡{(diào)。

4 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

在哺乳動物細(xì)胞中，主要發(fā)生DNA甲基化的位置為CpG二核苷酸的C5，并且通過兩大類酶活性進(jìn)行 - 維持甲基化和從頭甲基化。維持甲基化活性對于在每個細(xì)胞DNA復(fù)制周期后保持DNA甲基化是必需的。如果沒有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT），復(fù)制機(jī)制本身就會產(chǎn)生未甲基化的子鏈，并且隨著時間的推移會導(dǎo)致被動去甲基化。DNMT1是建議的維持甲基轉(zhuǎn)移酶，其負(fù)責(zé)在DNA復(fù)制期間將DNA甲基化模式復(fù)制到子鏈。由于DNMT1活性需要在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)育，因此缺失DNMT1兩個拷貝的小鼠模型在大約第9天是胚胎致死的。據(jù)認(rèn)為，DNMT3a和DNMT3b是在發(fā)育早期建立DNA甲基化模式的從頭甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMT3L是與其他DNMT3同源但不具有催化活性的蛋白質(zhì)。相反，DNMT3L通過增加其與DNA結(jié)合并刺激其活性的能力來輔助從頭甲基轉(zhuǎn)移酶。小鼠和大鼠具有名為DNMT3C 的第三種功能性從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，其在Muroidea嚙齒動物的共同祖先中通過串聯(lián)重復(fù)進(jìn)化為Dnmt3b的旁系同源物。DNMT3C在早期精子發(fā)生過程中催化轉(zhuǎn)座因子啟動子的甲基化，這種活動對于它們的表觀遺傳抑制和雄性生育能力是必不可少的[5.6]。由于許多腫瘤抑制基因在致癌過程中被DNA甲基化沉默，因此已經(jīng)嘗試通過抑制DNMT來重新表達(dá)這些基因。5-Aza-2-脫氧胞苷（地西他濱）是一種核苷類似物，通過阻止DNA消除催化步驟將它們捕獲在DNA上的共價復(fù)合物中來抑制DNMT，從而導(dǎo)致酶的降解。然而，為了使地西他濱具有活性，必須將其摻入基因組中如果細(xì)胞沒有死亡，細(xì)胞可以導(dǎo)致子細(xì)胞發(fā)生突變。此外，地西他濱對骨髓有毒，這限制了其治療窗口的大小。這些缺陷導(dǎo)致反義RNA療法的發(fā)展，通過降解其mRNA并阻止其翻譯來靶向DNMT。然而，目前還不清楚單獨(dú)靶向DNMT1是否足以重新激活DNA甲基化沉默的腫瘤抑制基因。

5 差異甲基化區(qū)域（DMRs）

差異甲基化區(qū)域是多個樣品（組織，細(xì)胞，個體或其他）中具有不同甲基化狀態(tài)的基因組區(qū)域，被認(rèn)為是參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的可能功能區(qū)域。多組織（T-DMR）中DMR的鑒定提供了對人組織之間的表觀遺傳差異的全面調(diào)查。例如，這些甲基化的區(qū)域所特有的特定組織允許個人組織類型之間進(jìn)行區(qū)分，諸如精液和陰道液。Lee等人目前的研究表明，DACT1和USP49通過檢測T-DMR來確定精液[7]。事實證明，使用T-DMR可以識別犯罪現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的各種體液。法醫(yī)領(lǐng)域的研究人員目前正在尋找基因中的新型T-DMR，用作法醫(yī)DNA分析中的標(biāo)記。癌癥和正常樣本（C-DMR）之間的DMR證明了癌癥中的異常甲基化。眾所周知，DNA甲基化與細(xì)胞的分化和增殖相關(guān)。

QDMR（定量差異甲基化區(qū)域）是量化甲基化差異的定量方法，并通過調(diào)整香農(nóng)熵從全基因組甲基化譜中鑒定DMR。QDMR的無平臺和無物種性質(zhì)使其可能適用于各種甲基化數(shù)據(jù)。該方法為表觀遺傳調(diào)控中涉及的功能區(qū)的高通量鑒定提供了有效的工具。QDMR可用作量化甲基化差異和識別多個樣品中DMR的有效工具。

6 DNA甲基化的應(yīng)用

6.1 DNA甲基化標(biāo)記

目前認(rèn)為DNA甲基化標(biāo)記--在特定生物狀態(tài)下具有特定甲基化模式的基因組區(qū)域，例如組織，細(xì)胞類型，個體--可能作為功能區(qū)參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。具有相同基因組的各類人類細(xì)胞卻有著不同甲基化組。要準(zhǔn)確理解確定細(xì)胞命運(yùn)的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制系統(tǒng)，鑒定和特性描述跨類型細(xì)胞的甲基化標(biāo)記尤其關(guān)鍵。劉洪波等提出了一種基于熵的框架（SMART）。將整個基因組亞硫酸氫鹽測序甲基化組件整合到42個人體組織/細(xì)胞中，并鑒定了757，887個基因組區(qū)段。其中75%左右的片段在所有類型的細(xì)胞中表達(dá)均一甲基化，另外25%中，他們使用統(tǒng)計學(xué)方法鑒定了在少數(shù)細(xì)胞類型中特異性低/高甲基化的細(xì)胞類型特異性低/高甲基化標(biāo)記，并呈現(xiàn)了人甲基化標(biāo)記的圖譜。通過深入分析可知，細(xì)胞類型特異性低甲基化標(biāo)記通過H3K27ac富集和細(xì)胞類型特異性方式的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。特別的是，細(xì)胞類型特異性低甲基化標(biāo)記與驅(qū)動細(xì)胞同一性基因表達(dá)的細(xì)胞類型特異性超增強(qiáng)劑相關(guān)。該框架為人類基因組的互補(bǔ)功能，以及不同類型細(xì)胞特異性低甲基化的關(guān)鍵功能和特征均提供了有力的解釋。

6.2 識別和檢測體液

DNA甲基化允許在一次測定中分析幾種組織以及使用提取的DNA鑒定少量體液。通常，DNA甲基化的兩種方法是甲基化敏感性限制酶或用鈉處理。亞硫酸氫鹽。甲基化敏感的限制酶通過裂解特定的CpG，胞嘧啶和鳥嘌呤僅由一個磷酸基團(tuán)分離，識別位點(diǎn)時所述CpG甲基化的工作。相反，該過程中甲基化的胞嘧啶保持甲基化，而未甲基化的胞嘧啶則被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，。特別是，甲基化譜可以提供關(guān)于何時或如何在犯罪現(xiàn)場留下體液，識別體液類型，以及肇事者的年齡，性別和表型特征的大致信息。在識別和檢測體液時，DNA甲基化提供了相對較好的靈敏度。在一項研究中，只需要10納克的樣本來確定成功的結(jié)果。

7 展望

DNA甲基化雖然不會改變DNA序列，僅修飾其表觀遺傳，但仍然在調(diào)控基因表達(dá)時起到關(guān)鍵作用。在各種表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象中，DNA甲基化雖然是最早被發(fā)現(xiàn)并且研究相對成熟的一種，但就目前而言，其機(jī)理機(jī)制仍比較淺薄。相信隨著表觀遺傳編輯、高通量測序及結(jié)構(gòu)分析等技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，對DNA甲基化機(jī)制的研究也將登上更高的臺階，這將使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的運(yùn)用更加深入、廣泛，找到疾病相對應(yīng)的DNA甲基化元件對各類疾病的診斷治療及預(yù)后檢測都有極大的幫助。

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