鯽魚中硝基呋喃代謝物測(cè)定及呋喃唑酮代謝規(guī)律研究

任召珍 陳志兵 劉志敏

摘要：建立鯽魚中硝基呋喃代謝物殘留量測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，并分析AOZ在鯽魚中殘留消除規(guī)律。樣品采用鹽酸、2-硝基苯甲醛衍生提取，乙酸乙酯萃取后，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)定量。結(jié)果顯示，該方法在0～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，4種硝基呋喃類代謝物回收率在91.7%～98.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.87%～6.93%，方法檢出限為SEM 0.40，AOZ 0.25，AMOZ 0.20，AHD 0.45。鯽魚內(nèi)AOZ殘留消除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AOZ停藥后最高蓄積殘留量為218.25 μg/kg。鯽魚肉內(nèi)AOZ代謝消除緩慢，120 d后代謝殘留物低于0.5 μg/kg。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;硝基呋喃代謝物;鯽魚;代謝規(guī)律

中圖分類號(hào)：TS207 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0238-04

硝基呋喃類藥物是一種抗生素，其代謝物主要有5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）4種，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用，主要用于防治敏感菌所致的細(xì)菌性痢疾、腸炎、霍亂。由于其廣譜的殺菌能力曾被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，但研究發(fā)現(xiàn)該類藥物具有相當(dāng)大的毒性，可致胎兒畸形、誘發(fā)癌癥等[1-2]。歐盟關(guān)于修訂有關(guān)指定用于確定最大殘留限量的共同體程序的第2377/90/EEC（1995）號(hào)指令中把硝基呋喃列入A類禁用藥[3]，并于2003年規(guī)定最低殘留限量（MRL）為1 μg/kg[4]。我國動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量——農(nóng)業(yè)部235公告也明確規(guī)定，此類藥物不得在動(dòng)物性食品中檢出[5]。即便如此，硝基呋喃類代謝物在動(dòng)物源食品中仍時(shí)有檢出。據(jù)山東省食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的食品安全通報(bào)發(fā)現(xiàn)，黃花魚、松花魚、雞肉等多起動(dòng)物源食品中呋喃唑酮代謝物超標(biāo)[6]。目前，硝基呋喃代謝物的分析方法有酶聯(lián)免疫法[7]、高效液相色譜法[8-9]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好等特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上以鯽魚為研究對(duì)象，采用更為便捷的檢測(cè)方法對(duì)鯽魚中硝基呋喃類代謝物進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)呋喃唑酮的代謝規(guī)律進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 甲醇、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、2-硝基苯甲醛、醋酸銨皆為色譜純;鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀皆為分析純;標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr. Ehrenstorfer標(biāo)準(zhǔn)品公司，純度≥99.0%;水為超純水。

1.1.2 硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 采用甲醇溶液分別將AOZ、AMOZ、AHD、SEM溶解配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-18 ℃冰箱避光保存。

1.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 分別準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，將以上4種硝基呋喃代謝物配制成濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，置于-18 ℃冰箱避光保存。

1.2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）：Thermo TSQ Quantum Access Max，電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司];旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（東京理化器械株式會(huì)社）;離心機(jī)（株式會(huì)社日立制作所）;均質(zhì)器（IKAT18）;旋渦混合器（德國IKA公司）;pH計(jì)（梅特勒—托利多集團(tuán)）;恒溫水浴振動(dòng)器（常州國華電器有限公司，SHA-B）;氮吹儀（鄭州安晟科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 水解和衍生

準(zhǔn)確稱取制備均勻的鯽魚樣品2.00 g（精確至0.01 g）于 50 mL 離心管中，加入10 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液，加入適量?jī)?nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μL 100 mmol/L 2-硝基苯甲醛溶液），旋渦均勻，放入37 ℃水浴避光振蕩16 h。

1.4 提取凈化

將水解衍生完成的樣品取置室溫，于離心管中加入 1.5 mL 1 mol/L磷酸氫二鉀溶液，并用3 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5間。10 000 r/min離心5 min，上清溶液轉(zhuǎn)移至另一離心管中并加入10 mL乙酸乙酯，高速渦旋振蕩 1 min，再次10 000 r/min離心5 min，取乙酸乙酯層于 15 mL 離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈伞?zhǔn)確加入1.0 mL甲醇-水溶液（體積比為8 ∶ 2），2 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，取下層溶液于 1.5 mL EP管中，15 000 r/min離心10 min，定容液經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)品采用與樣品相同方法處理后待測(cè)。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 液相條件 色譜柱：C18，10 cm×5 μm×0.21 mm（Thermo）;柱溫：30 ℃;流速：250 μL/min;進(jìn)樣量：10 μL;流動(dòng)相：甲醇/5 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%甲酸）。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源溫度（配備ESI源）：350 ℃;噴霧電壓：4 500 V;鞘氣：40arb;輔助氣：10arb;硝基呋喃代謝物的離子參數(shù)見表1。

1.6 AOZ在鯽魚中的代謝試驗(yàn)

配制含AOZ 2 mg/kg濃度飼料，鯽魚苗體長(zhǎng)約4 cm，養(yǎng)殖水溫為（20±2） ℃，養(yǎng)殖密度為30尾/m3，投喂量為3%，每天投喂2次（上午、下午各1次），投喂時(shí)間為5 d。養(yǎng)殖密9度和飼料粒徑隨鯽魚增長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)整。投喂結(jié)束后2、4、6、12 h，1、2、4、8、16、20、30、40、60、90、120 d取樣測(cè)定鯽魚肉中AOZ殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取2.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品，由蠕動(dòng)泵進(jìn)入質(zhì)譜，離子源切換到正離子模式，調(diào)試離子源的噴霧電壓，觀察硝基呋喃化合物Full Scan模式下母離子的響應(yīng)情況，確定噴霧電壓、鞘氣和輔助氣流量;在MRM模式下自動(dòng)掃描，確定響應(yīng)最高、最穩(wěn)定的碰撞能量，由此確定該方法的質(zhì)譜條件，參數(shù)見表1。2 μg/L 濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品參考圖譜（圖1）。在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，4種硝基呋喃代謝物8 μg/L濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品分離度合理，峰形對(duì)稱且峰形良好，并且在儀器上表現(xiàn)出良好的響應(yīng)，靈敏度高，在此條件下可以進(jìn)行4種硝基呋喃代謝物的分離測(cè)定。

2.2 液相條件的優(yōu)化

根據(jù)硝基呋喃類藥物性質(zhì)及質(zhì)譜條件，采用乙腈或甲醇作為有機(jī)相，0.1%甲酸和5 mmoL/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）作為水相。根據(jù)調(diào)試，甲醇可更好地提高檢測(cè)靈敏度和分離效果，水相中加入乙酸銨可提高離子化效率，以獲得理想色譜峰，因此確定使用甲醇-5 mmoL/L乙酸銨溶液（含 0.1% 甲酸）做流動(dòng)相，具體的流動(dòng)相比例詳見表2。

2.3 線性方程和檢出限

配制濃度為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，以內(nèi)標(biāo)法定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，硝基呋喃化合物在0～20.0 μg/L濃度范圍內(nèi)響應(yīng)呈線性關(guān)系（r2>0.99），以信噪比（S/N）=3及標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算硝基呋喃類代謝物檢出限，詳見表3。

2.4 衍生條件的優(yōu)化

2.4.1 2-硝基苯甲醛溶劑的選擇 由于硝基呋喃類代謝物分子量小，HPLC-MS/MS直接測(cè)定響應(yīng)不好，靈敏度低，因此一般對(duì)其衍生化后再進(jìn)行測(cè)定，常用衍生化試劑是2-硝基苯甲醛[14]。2-硝基苯甲醛常用二甲亞砜[10-11]和甲醇[12]溶解。試驗(yàn)過程中衍生濃度2 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別使用甲醇和二甲亞砜溶解，2-硝基苯甲醛作為衍生化試劑，詳見表4。由結(jié)果可知，甲醇和二甲亞砜溶解的衍生化試劑對(duì)結(jié)果并無太大影響，考慮二甲亞砜易滲入皮膚，低溫易凝固的特點(diǎn)，本試驗(yàn)采用甲醇溶解2-硝基苯甲醛。

2.4.2 衍生方式的選擇 根據(jù)目前硝基呋喃代謝物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，衍生方式有避光衍生[10-11]和直接衍生[12]，本試驗(yàn)對(duì) 2 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行避光衍生和直接衍生，結(jié)果見表5。由于硝基呋喃類藥物代謝快速且對(duì)光敏感[15]，所以進(jìn)行避光衍生。

2.5 提取條件的優(yōu)化

2.5.1 離心速率影響 通常硝基呋喃類藥物在提取時(shí)采用4 000 r/min離心[10-11]，但對(duì)于蛋白和脂肪含量高的樣品，在此速率下即使離心10 min，離心管上層仍漂浮有雜質(zhì)，另外用乙酸乙酯提取時(shí)，也易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，若分離不完全，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果會(huì)造成一定影響。提高離心速率對(duì)這類現(xiàn)象有明顯改善，離心速率越高效果越好，因此本試驗(yàn)在分離和提取過程中皆采用10 000 r/min離心分離。氮吹后，采用正己烷除脂后易出現(xiàn)定容液與正己烷乳化現(xiàn)象，在15 000 r/min下離心 10 min，可使正己烷漂浮于上層，可徹底除去提取的脂肪，降低樣品基質(zhì)干擾。

2.5.2 乙酸乙酯提取次數(shù)的影響 農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4-2006[10]和GB/T 21311—2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類代謝殘留量監(jiān)測(cè)方法》[12]標(biāo)準(zhǔn)方法中乙酸乙酯皆提取2次。因硝基呋喃類藥物采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，通過質(zhì)控樣品分析發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取1次，硝基呋喃類藥物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在范圍內(nèi)，詳見表6。因此采用1次提取法，不僅可簡(jiǎn)化提取步驟，還可減少試劑使用。

2.6 回收率試驗(yàn)

取陰性鯽魚肉樣，分別加入硝基呋喃類標(biāo)準(zhǔn)品，使添加濃度分別為0.5、1.0、5.0 μg/L，每個(gè)濃度6個(gè)平行樣品，測(cè)其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表6可知，本方法4種硝基呋喃類代謝物的回收率均為91.7%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.87%～6.93%，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.7 AOZ在鯽魚內(nèi)的代謝規(guī)律

由圖2可知，AOZ在鯽魚中投喂結(jié)束后0～6 h，AOZ含量呈上升趨勢(shì)，在 6 h時(shí)測(cè)得最高含量為218.25 μg/kg，在 6～96 h 間AOZ殘留量下降趨勢(shì)明顯，之后呈緩慢下降趨勢(shì)，直至120 d后在鯽魚中無AOZ檢出。這與譚志軍等研究呋喃唑酮對(duì)大菱鲆內(nèi)的代謝規(guī)律[16]和劉書貴等研究呋喃唑酮在雜交鱧（斑鱧♀×烏鱧♂）體內(nèi)殘留消除規(guī)律[17]有相似之處。據(jù)食品藥品監(jiān)督管理局的食品安全抽查結(jié)果顯示，當(dāng)前水產(chǎn)品中呋喃唑酮仍時(shí)有檢出，說明仍存在違禁使用現(xiàn)象。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AOZ在鯽魚體內(nèi)代謝消除仍然非常緩慢，如果違禁使用還是存在很大風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本研究建立了以鹽酸溶液衍生提取，乙酸乙酯萃取，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，并以對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)定量的硝基呋喃類代謝物殘留測(cè)定方法。方法準(zhǔn)確度高、精密度好、符合殘留檢測(cè)要求。通過對(duì)飼喂鯽魚中AOZ殘留消除規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，AOZ在本試驗(yàn)條件下，120 d后鯽魚中AOZ殘留完全消除。如果試劑使用劑量大或時(shí)間長(zhǎng)，消除時(shí)間還可能更長(zhǎng)，因此違禁使用AOZ存在很大風(fēng)險(xiǎn)，這為硝基呋喃類藥物的監(jiān)管提供了一定試驗(yàn)依據(jù)。

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