一起霍亂疫情分離株的耐藥性和分子流行病學(xué)分析

王云霞 嚴(yán)寒秋 劉海波 史文鳳 周海健 王斌

2017年7月，北京市房山區(qū)疾控中心接到轄區(qū)某醫(yī)院疑似霍亂病例的報告，通過流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測，最終確定其病原菌是O1群小川型霍亂弧菌，CT(cholera toxin)毒素陰性，溯源表明疫情與廚師有關(guān)。現(xiàn)分析該起霍亂疫情分離株的耐藥性和分子流行病學(xué)特征，為霍亂疫情防控提供可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來源：樣本來自疫情中采集的患者便標(biāo)本1件、密切接觸者肛拭子37件(家屬3件,其他密接34件)、患者就餐地廚師肛拭子4件、患者就餐地后廚外環(huán)境和食物原料等各種涂抹67件，共109件樣本，均放置pH=8.8堿性蛋白胨水增菌液中，常溫保存，立即送檢。

1.1.2試劑：堿性蛋白胨水和慶大霉素平板購自友康恒業(yè)生物科技(北京)有限公司，霍亂弧菌血清購自泰國S&A REAGENTS LAB公司和鄭州萬泰生物科技有限公司，霍亂弧菌O1/O139群和霍亂弧菌 CTX基因核酸檢測試劑盒購自江蘇碩世生物科技股份有限公司；革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板購自上海星佰生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NotI、SfiⅠ購自美國NEB公司。上述試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.1.3儀器：瑞士Roche LightCycler 480實(shí)時熒光定量PCR儀；美國Bio-rad CHEF Mapper system脈沖場凝膠電泳儀；美國Bio-rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)；上海星佰生物技術(shù)有限公司微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1病原菌常規(guī)分離培養(yǎng): 按《霍亂防治手冊》(第6版)和《霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 289-2008)對109件樣本進(jìn)行增菌、分離培養(yǎng)、玻片凝集實(shí)驗(yàn)和生化鑒定[1-2]。

1.2.2霍亂弧菌實(shí)時熒光PCR法: (1)實(shí)時熒光PCR檢測霍亂弧菌O1/O139群特異性基因：取37 ℃培養(yǎng)6 h的堿性蛋白胨水增菌液2 mL，于無菌2 mL離心管中，共109件樣本。用德國Minispin plus 12 000 r/min離心3 min，棄上清留沉淀。在該離心管中加入1 mL DEPC水，使管中沉淀懸浮均勻，再次同上離心棄上清留沉淀。在該離心管中加入130 μL DEPC水，使沉淀懸浮均勻后100 ℃加熱10 min，12 000 r/ min 離心10 min，取上清100 μL為基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用霍亂弧菌O1/O139群核酸檢測試劑盒，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR法檢測霍亂弧菌O1/O139群特異性基因，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。熒光曲線Ct值≤35 且曲線呈“S”形判為陽性，提示樣本中含有O1或O139群霍亂弧菌；否則陰性,提示樣本中不含有O1或O139群霍亂弧菌。(2)實(shí)時熒光PCR檢測霍亂弧菌CTX基因：常規(guī)分離培養(yǎng)陽性的菌株接種LB瓊脂，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取LB平板上的單菌落于130 μL DEPC水中，采用上述水煮法提取基因組DNA。使用霍亂弧菌CTX基因核酸檢測試劑盒,進(jìn)行實(shí)時熒光PCR法檢測霍亂弧菌CTX基因，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。熒光曲線Ct值≤35且曲線呈“S”形判為陽性，提示樣本為產(chǎn)毒株；否則陰性，提示樣本為非產(chǎn)毒株。

1.2.3藥物敏感試驗(yàn): 采用96孔微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，試驗(yàn)藥物共20種：氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸鉀、阿米卡星、頭孢吡肟、美羅培南、左氧氟沙星、多西環(huán)素(強(qiáng)力霉素)和鏈霉素。藥敏板上倍比稀釋濃度單位為μg/mL，挑取LB平板37 ℃培養(yǎng)18 h的純菌，置于2 mL滅菌生理鹽水中，配(0.52±0.2)麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?濃度約1.5×108cfu/mL)，藥敏板35 ℃培養(yǎng)19 h，結(jié)果判斷等其余操作均按上海星佰生物技術(shù)有限公司微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行。

1.2.4脈沖場凝膠電泳(PFGE)實(shí)驗(yàn)及聚類分析: 參照國家致病菌識別網(wǎng)和Pulse Net China監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)中霍亂弧菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行PFGE[3]。菌懸液濃度為4.2～4.4麥?zhǔn)蠁挝唬?4 ℃水浴細(xì)菌裂解1 h，DNA用內(nèi)切酶NotI和SfiI酶切4.5 h,酶切溫度分別為37 ℃和50 ℃。脈沖場凝膠電泳條件：2～10 s，13 h； 20～25 s，6 h。電泳前加硫脲(終濃度為38 μL/100 mL)，電泳后染色0.5 h，普通水脫色1.5 h，用凝膠成像系統(tǒng)照相，把膠塊放在調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線內(nèi)，使膠塊的加樣孔和調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線的最上面一條藍(lán)線對齊,獲取合格的圖像。分子量標(biāo)準(zhǔn)為沙門菌H9812。用BioNumerics(Version 5.01)軟件對圖像進(jìn)行處理,用UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)方法構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果

2.1霍亂弧菌O1/O139群特異性基因結(jié)果 109件樣本增菌液,使用實(shí)時熒光PCR法檢測O1/O139群霍亂弧菌特異性基因，O1群霍亂弧菌特異性基因陽性21件，其中患者便標(biāo)本陽性1件，密接中家屬肛拭子陽性1件,患者就餐地廚師肛拭子陽性1件,患者就餐地后廚外環(huán)境各種涂抹陽性18件，陽性率19.27%；109件樣本增菌液O139群霍亂弧菌特異性基因均為陰性。初步可判斷該疫情為O1群霍亂弧菌引起。

2.2常規(guī)分離培養(yǎng)結(jié)果 109件樣本進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)及鑒定,檢出6株O1群小川型霍亂弧菌(均從熒光PCR法陽性樣本中分離，另外15件熒光PCR法陽性樣本中未檢出霍亂弧菌),其中患者便標(biāo)本檢出1株，患者就餐地廚師肛拭子檢出1株，患者就餐地后廚外環(huán)境各種涂抹檢出4株，陽性率5.50%；109件樣本均未檢出O139群霍亂弧菌。

2.3實(shí)時熒光PCR檢測霍亂弧菌CTX基因結(jié)果 6株O1群小川型霍亂弧菌,使用實(shí)時熒光PCR法檢測霍亂弧菌 CTX基因。6株菌均為霍亂CTX基因陰性，為非產(chǎn)毒株。

2.4藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 對6株O1群小川型非產(chǎn)毒株霍亂弧菌進(jìn)行了20種抗生素藥敏試驗(yàn)，四環(huán)素、氯霉素、復(fù)方新諾明、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、美羅培南、左氧氟沙星和多西環(huán)素(強(qiáng)力霉素)共12種抗生素100%敏感，頭孢唑林(為頭孢一代)100%耐藥,頭孢噻肟和頭孢他啶(為頭孢三代)和頭孢吡肟(為頭孢四代)出現(xiàn)了部分耐藥(表1)。

表1 6株O1群霍亂弧菌對20種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(株)

2.5PFGE分子分型結(jié)果 對6株O1群小川型非產(chǎn)毒株霍亂弧菌(2017HL002-007)用NotI和SfiⅠ 酶切，進(jìn)行PFGE分子分型，圖譜用BioNumerics軟件分析，并通過與Pulse Net China霍亂弧菌PFGE分型數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，NotI和SfiI酶切的電泳圖譜均為唯一帶型，分別命名為KZGN11O1.CN1217 和KZGS12O1.CN0548。此次疫情分離的6株菌呈現(xiàn)的條帶相似度系數(shù)為100.0%，與2017年北京市分離的其余3株O1群霍亂弧菌相似度系數(shù)為70.0%(條帶數(shù)差異大于10條,圖1)。

注：菌株BJ2017HL002-BJ2017J007是本次疫情分離菌株；BJ2017HL001、BJ2017HL008、BJ2017HL009是北京市2017年其他霍亂疫情分離菌株。圖1 NotI和SfiⅠ酶切6株菌在北京市2017年霍亂弧菌PFGE數(shù)據(jù)庫中的分型結(jié)果

3 討論

3.1霍亂弧菌中O1/O139血清群霍亂弧菌可引起急性腸道傳染病，CT為霍亂弧菌主要毒力因子，是目前已知致瀉毒素中最強(qiáng)烈的一種[1]。2007-2014年，北京市霍亂弧菌日常監(jiān)測中檢出的125株O1群霍亂弧菌以小川型非產(chǎn)毒株為主導(dǎo)[4]，國內(nèi)其他省市也有非產(chǎn)毒株引起腹瀉疫情報道[5]，此次疫情也是非產(chǎn)毒株引起。因此，在霍亂弧菌常規(guī)監(jiān)測中應(yīng)提高對非產(chǎn)毒株的重視。

3.2霍亂弧菌疫情報告有著極高的敏感性，傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時長、工作量大、靈敏度低，且容易造成漏檢。目前,更加快捷的分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測中[6-8]，LYON[9]利用Real-time PCR 探針法檢測霍亂弧菌hlyA基因，僅用3 h，且最低檢測靈敏度達(dá)到了 8 cfu/g(糞便樣)、10 cfu/mL(水樣)。本次疫情先采用熒光定量PCR法檢測109件樣本增菌液,共有21件樣本O1群霍亂弧菌特異性基因陽性，得以快速鎖定目標(biāo)病原菌為O1群霍亂弧菌。在后期分離培養(yǎng)中，109件樣本檢出6株O1群小川型霍亂弧菌，均從熒光PCR法陽性樣本中分離得到，另外15件PCR法陽性的樣本及88件PCR法陰性的樣本，均未檢出霍亂弧菌。由此可見，熒光定量PCR法和經(jīng)典的分離培養(yǎng)法有機(jī)結(jié)合，能快速確定病原菌，這與有關(guān)報道是一致的[10]。

3.3對6株霍亂弧菌進(jìn)行抗菌藥物敏感性分析,結(jié)果顯示這6株霍亂弧菌對20種藥物中的12種100%敏感，對頭孢唑林(為頭孢一代)100%耐藥,可作為對此次疫情相關(guān)病例及帶菌者進(jìn)行藥物治療的依據(jù)；另外，6株霍亂弧菌對頭孢噻肟和頭孢他啶(為頭孢三代)及頭孢吡肟(為頭孢四代)出現(xiàn)部分耐藥，二代頭孢霉素頭孢西丁其母核與頭孢菌素相似，抗菌活性與頭孢二代相似，但是試驗(yàn)結(jié)果100%敏感。所以下一步應(yīng)對這6株菌耐藥基因和耐藥整合子是否有差異進(jìn)行深入研究[11]，從分子水平闡明其耐藥特性。

3.4PFGE是致病菌引起的疫情溯源的“金標(biāo)準(zhǔn)”,有報道對NotⅠ和SfiⅠ進(jìn)行了深入的比較研究，認(rèn)為同時使用兩種酶更能從多角度準(zhǔn)確的研究菌株間相關(guān)性[12]。此次疫情流調(diào)報告為O1群小川型霍亂弧菌陽性的廚師未出現(xiàn)腹瀉癥狀，呈健康狀態(tài)。此次疫情，后廚的水池、加工臺面、洗魚池及餐盤涂抹標(biāo)本分離的4株菌同患者和廚師分離的2株菌，應(yīng)用了NotⅠ和SfiⅠ兩種酶進(jìn)行酶切，依據(jù)PFGE圖譜結(jié)果，其相似度系數(shù)為100.0%，具有一致性，即高度同源，與2017年北京市數(shù)據(jù)庫中的其他菌株相似度系數(shù)為70.0%，親緣關(guān)系相差較遠(yuǎn)。所以推測健康帶菌廚師為此次疫情的傳染源，在工作中污染了后廚的環(huán)境，最終感染了患者。因此，在霍亂流行季節(jié)，應(yīng)強(qiáng)化日常監(jiān)測，特別是加強(qiáng)餐飲從業(yè)人員健康體檢，有效切斷健康帶菌者這一傳染源，同時普及食品安全教育，從多方位預(yù)防霍亂疫情的發(fā)生。