6-姜辣素對人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

于杰濱 邵明舉

(山東大學(xué)第二醫(yī)院急診科，山東 濟(jì)南 250033)

乳腺癌約占所有女性腫瘤的25%，每年約有100多萬女性新診斷為乳腺癌，其中有50萬人會死于乳腺癌〔1〕。手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療及放療仍作為目前治療乳腺癌的主要方法，但這些治療手段并不能完全有效地對抗乳腺癌。此外，放化療及激素治療通常會伴隨一些不可耐受的副反應(yīng)〔2〕。目前，在天然中草藥中尋找具有抗癌效果的小分子已成為腫瘤藥物研發(fā)的重點〔3〕。生姜，最初起源于東南亞地區(qū)，隨后被引入世界多地種植，其作為日常生活中的調(diào)味品和中藥已有幾千年的歷史〔4〕。6-姜辣素作為生姜的主要成分，現(xiàn)代藥理學(xué)已證實其具有抗氧化活性、抑制血小板聚集、保護(hù)胃黏膜等功效〔5〕。近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌、骨肉瘤中具有抗癌效果〔6～9〕。6-姜辣素發(fā)揮抗癌效果主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、發(fā)揮細(xì)胞毒性、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等發(fā)揮作用〔10〕。雖然報道6-姜辣素可以抑制乳腺癌細(xì)胞進(jìn)展，但未對其具體機(jī)制深入研究。本文旨在探究6-姜辣素對乳腺癌增殖和凋亡的影響，并探究其內(nèi)在分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231購于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；DMEM和RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于以色列BI公司；6-姜辣素和二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8細(xì)胞增殖和活性檢測試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司；一抗抗體促凋亡蛋白(Bad)、兔抗人單克隆抗體(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)均購于CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自沈陽萬類生物有限公司；二抗購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231分別培養(yǎng)于改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和RPMI1640培養(yǎng)基(包含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)中，并放置于含5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞孵育箱中37℃培養(yǎng)，每2～3 d給予換液，當(dāng)細(xì)胞長至90%左右，用0.25%胰酶消化離心并重懸，后種于新的培養(yǎng)皿中。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期生長的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞種于96孔板，每孔5 000個，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待4～6 h后細(xì)胞貼壁，加入不同濃度6-姜辣素處理(0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)乳腺癌細(xì)胞24 h，選擇60 μmol/L 6-姜辣素分別處理24、36、48 h,每個處理組設(shè)置5個復(fù)孔。結(jié)束后，將舊培養(yǎng)基棄掉并更換為新的完全培養(yǎng)基100 μl/孔，同時加入CCK-8 10 μl，培養(yǎng)箱孵育2 h后使用酶標(biāo)儀490 nm處檢測各孔吸光度。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231以1×106/孔的濃度種于6孔板內(nèi)，加入0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L的6-姜辣素處理24 h，隨后用胰蛋白酶消化離心并收集細(xì)胞，用提前預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，加入200 μl結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml，取100 μl緩沖液至流式管內(nèi)，分別加入5 μl 的Annexin V-FITC和PI，混勻后于室溫避光孵育15 min，加入結(jié)合液后應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析凋亡率。

1.5 Western印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 將長至80%～90%的乳腺癌細(xì)胞以不同濃度的6-姜辣素(0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)處理24 h，隨后用PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液靜置5 min后用刮勺將細(xì)胞刮下并收集到1.5 ml EP管內(nèi)，于冰上放置10 min使其充分裂解，后在4℃離心機(jī)中離心15 min，轉(zhuǎn)速15 000 r/min。將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)，并加入1/4體積的5×上樣緩沖液于100℃煮沸5 min使其變性。剩余蛋白取5 μl使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測蛋白濃度。取30 μg蛋白使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白分離及轉(zhuǎn)膜，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入目的抗體4℃過夜孵育，TBST洗膜液洗膜3次，10 min/次，后加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜液洗膜3次，10 min/次，使用ECL顯影液顯影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 6-姜辣素抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖能力 使用不同濃度6-姜辣素(0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)分別處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231各24 h，及60 μmol/L 6-姜辣素分別處理24、36、48 h，利用CCK-8檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素對乳腺癌細(xì)胞具有明顯抑制作用(P<0.05,P<0.01)，并且該抑制作用呈時間和濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01,P<0.001)。見表1，表2。

表1 不同濃度6-姜辣素中MCF-7、MDA-MB-231存活率(%)

與對照組相比:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001,下表同

表2 不同時間60 μmol/L 6-姜辣素中MCF-7和MDA-MB-231存活率(%)

2.2 6-姜辣素促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡 在MCF-7細(xì)胞中，對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)細(xì)胞凋亡率為(4.42±1.12)%，而40 μmol/L和60 μmol/L 6-姜辣素處理組細(xì)胞凋亡率分別為(27.39±2.32)%和(41.85±5.08)%，與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，對照組細(xì)胞凋亡率為(5.03±0.92)%，而40 μmol/L和60 μmol/L 6-姜辣素處理組細(xì)胞凋亡率分別為(30.45±1.37)%和(47.33±3.63)%，與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.3 6-姜辣素影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 使用不同濃度6-姜辣素〔對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L〕處理乳腺癌細(xì)胞系24 h，利用Western印跡檢測促進(jìn)凋亡蛋白Bad、Bax及抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的Bad表達(dá)水平依次為24%、46%、74%，Bax表達(dá)水平依次為13%、26%、35%，Bcl-2表達(dá)水平依次為91%、74%、52%。MDA-MB-231細(xì)胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的Bad表達(dá)水平依次為11%、18%、27%，Bax表達(dá)水平依次為7%、14%、24%，Bcl-2表達(dá)水平依次為42%、26%、9%。MCF-7細(xì)胞，與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素可以促進(jìn)Bad、Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 2A)；在MDA-MB-231細(xì)胞中，可以得到相同的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 2B)。

2.4 6-姜辣素通過AMPK/mTOR信號通路影響乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡 選用MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系，使用不同濃度6-姜辣素(0 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)處理24 h，利用Western印跡檢測p-AMPK和p-mTOR的表達(dá)。結(jié)果顯示,MCF-7細(xì)胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的p-AMPK表達(dá)水平依次為21%、43%、67%，p-mTOR表達(dá)水平依次為41%、17%、9%。MDA-MB-231細(xì)胞在對照組(0 μmol/L)、40 μmol/L、60 μmol/L 6-姜辣素中的p-AMPK表達(dá)水平依次為11%、24%、38%，p-mTOR表達(dá)水平依次為56%、27%、14%。與對照組(0 μmol/L 6-姜辣素)相比，6-姜辣素可以促進(jìn)MCF-7(圖 3A)和MDA-MB-231(圖 3B)細(xì)胞p-AMPK的表達(dá)，抑制p-mTOR的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示6-姜辣素可以激活A(yù)MPK/mTOR信號通路。

1～3：0、40、60 μmol/L 6-姜辣素；下圖同圖2 6-姜辣素影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(Western印跡)

圖3 6-姜辣素激活A(yù)MPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡(Western印跡)

3 討 論

乳腺癌通常伴隨較高的發(fā)病率和死亡率。手術(shù)聯(lián)合輔助治療仍然是目前乳腺癌的主要治療策略。此外，分子靶向治療也已漸漸應(yīng)用在臨床上了。但是在治療侵襲性乳腺癌時，化療耐藥和藥物毒性反應(yīng)通常是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。因此，尋找一種能特異并高效殺死乳腺癌細(xì)胞的藥物顯得尤為迫切。

在中國，生姜用來治療頭痛、鼻塞、感冒已有2 500年歷史了，而在一些西方國家生姜最早被用來治療關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病和肌肉不適。除此之外，目前已有研究證實生姜具有抗癌功效。一項流行病學(xué)調(diào)查顯示，由于日常飲食中含有大量生姜，東南亞國家的結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌和其他腫瘤的發(fā)病率明顯低于一些西方國家〔11〕。生姜主要包括揮發(fā)油、姜辣素及二苯基庚烷等三種成分，其中關(guān)于姜辣素的研究迄今已有100多年的歷史。早在二十世紀(jì)90年代，Unnikrishnan就發(fā)現(xiàn)姜辣素在體外可以抑制淋巴瘤細(xì)胞，但未對其機(jī)制做出解釋。隨后Lee等〔12〕研究證實姜辣素可以通過誘導(dǎo)凋亡抑制人腫瘤細(xì)胞增殖。既往已有研究報道，6-姜辣素通過活化p53誘導(dǎo)凋亡進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖〔13〕。本研究結(jié)果提示6-姜辣素可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

AMP激活的蛋白激酶AMPK是一種存在于真核生物中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)器，激活A(yù)MPK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等多種生命活動〔14,15〕。AMPK激活后可以抑制其下游底物mTOR，進(jìn)而抑制蛋白合成和腫瘤生長。本研究結(jié)果提示6-姜辣素激活A(yù)MPK/mTOR信號通路。