人參水煎煮的科學(xué)性探索
——水煎煮引發(fā)人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化△

楊秀偉，張雷

北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系/天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191

傳統(tǒng)中藥人參(Ginseng Radix et Rhizoma)系五加科多年生草本植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，馳名中外，獲譽(yù)“百草之王”。早在遠(yuǎn)古皇帝時(shí)代，有關(guān)人參的神奇功效就已為人所知，人參已有4000多年的應(yīng)用歷史；為了滿足需要，西晉末年，已經(jīng)開(kāi)始栽培人參，距今已有1600多年的歷史。有關(guān)人參的記載，見(jiàn)于春秋時(shí)期越國(guó)宰相范蠡著《范子計(jì)然》一書(shū)，書(shū)中有“人參出上黨，狀類人形者善”的描述。我國(guó)最早的藥學(xué)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“人參味甘，主補(bǔ)五臟、安精神、定魂魄、止驚悸、除邪氣、明目、開(kāi)心、益智，久服輕身延年”。東漢時(shí)期名醫(yī)張仲景所著《傷寒論》一書(shū)中共有113個(gè)成方，其中含有人參的配方達(dá)21個(gè)，并論述人參具有“溫補(bǔ)、滋潤(rùn)、強(qiáng)壯、強(qiáng)精、保溫、增強(qiáng)視力、安定精神”等作用。從古至今，人參或以“獨(dú)參湯”形式藥物應(yīng)用，或以“配方”形式藥物應(yīng)用，民間作為補(bǔ)品煲湯飲用。自1963年科學(xué)家從人參中分離鑒定出人參皂苷(ginsenoside，G)[1-2]以來(lái)，現(xiàn)代科學(xué)研究已充分證明，人參皂苷幾乎反映了人參的全部藥理學(xué)作用。由于人參為水煎劑形式用藥，本文探討人參水煎煮的科學(xué)性——水煎煮引發(fā)人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括Nexera X2 UFLC液相系統(tǒng)：LC-30AD二元泵、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M30A檢測(cè)器、CTO-20AC柱溫箱；8050型三重四級(jí)桿定量質(zhì)譜：配備ESI離子源和LabSolution工作站；Mettler XS105DU十萬(wàn)分之一電子天平(METTLER TOLEDO，Zurich，Switzerland)；AR4120型萬(wàn)分之一電子天平[奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；KQ5200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz)。

1.2 材料

人參飲片(批號(hào)：PG-Y-201606)購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)本文作者之一楊秀偉教授鑒定為PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖。

對(duì)照品人參皂苷G-Re(1)、G-Rb1(2)、20(S)-G-Rh1(3)、20(S)-G-Rg2(4)、20(R)-G-Rg2(5)、G-Rc(6)、20(R)-G-Rh1(7)、G-Rb2(8)、G-Rb3(9)、G-Rd(10)、G-Rg6(11)、G-F4(12)、G-Rk3(13)、G-Rh4(14)、20(S)-G-Rg3(15)、20(R)-G-Rg3(16)、20(S)-PPT(17)、20(R)-PPT(18)、G-Rk1(19)、G-Rg5(20)、20(S)-G-Rh2(21)、20(R)-G-Rh2(22)、20(S)-PPD(23)、20(R)-PPD(24)，系本課題組從生曬參[3]、紅參[4]、人參莖葉[5]或人參莖葉總皂苷酸水解產(chǎn)物[6]中分離制備，純度經(jīng)LC-MS驗(yàn)證均大于98%。以上24個(gè)對(duì)照品的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3～4。

LC-MS級(jí)別乙腈和甲醇購(gòu)自Fisher Scientific Inc.(Pittsburgh，PA，USA)；色譜純級(jí)別乙腈、甲醇為天津西華特種試劑廠產(chǎn)品；超純水(18 MΩ·cm-1)為本實(shí)驗(yàn)室用Milli-Q Advantage A10(Millipore，Billerica，USA)制水機(jī)自制；HPLC級(jí)別醋酸銨購(gòu)自Sigma-Aldrich(Lot#BCBK6717V，Sigma-Aldrich，Co.，MO，USA)。

2 實(shí)驗(yàn)條件和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

液質(zhì)分析C18色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Part#186002854，Ser# 01603514816023，Made in Ireland)；配有相同填料預(yù)柱Waters ACQUITY UPLC?BEH Shield RP18VanGuardTM Pre-Column(5 mm×2.1 mm，1.7 μm，Part#186003977，Lot#0158351601，Made in Ireland)。流動(dòng)相為0.5 mmol·L-1醋酸銨水溶液(流動(dòng)相A)和乙腈(流動(dòng)相B)。采用梯度洗脫方式，梯度洗脫程序：0～3 min，20%～22%B；3～5 min，22%～30%B；5～9 min，30%～33%B；9～11 min，33%～35%B；11～13 min，35%～42%B；13～23 min，42%～47%B；23～24 min，47%～52%B；24～29 min，52%～55%B；29～29.1 min，55%～60%B；29.1～34 min，60%～65%B；34～36 min，65%～95%B。流速設(shè)為0.4 mL·min-1，柱溫控制在30 ℃，進(jìn)樣體積為1 μL。

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如下：霧化氣流速：3 L·min-1；干燥氣流速：10 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；接口加熱器溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；接口電壓：-3.0 kV；檢測(cè)器電壓：1.80 kV。電離源為電噴霧離子源，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，掃描模式為負(fù)離子模式。

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制

精密稱取各對(duì)照品適量，溶解于質(zhì)譜級(jí)別甲醇中，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別移取適量?jī)?chǔ)備液混合并稀釋制成混合對(duì)照品母液。連續(xù)稀釋混合對(duì)照品母液得到一系列混合對(duì)照品線性工作液。

2.3 分析樣品的制備

2.3.1 水超聲提取 人參飲片粉碎過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱取1 g加入40 mL水，常溫下超聲提取兩次，每次1 h，過(guò)濾，即得25 mg·mL-1(以生藥計(jì))樣品溶液。再次用水稀釋至0.5 mg·mL-1(以生藥計(jì))，平行制備兩份樣品。

2.3.2 水回流提取 稱取人參飲片5 g，加入275 mL蒸餾水，水回流提取2 h，過(guò)濾。濾渣再次加入275 mL蒸餾水回流2 h，過(guò)濾后合并兩次濾液，水浴蒸至約50 mL，加入100 mL乙醇使醇濃度約為65%，4 ℃靜置過(guò)夜，在3000 r·min-1離心10 min，收集上清。上清減壓濃縮除去乙醇后冷凍干燥，稱質(zhì)量，密封保存。分析前分別稱取適量提取物溶解于甲醇制成25、0.5 mg·mL-1(以生藥計(jì))的樣品溶液，平行制備兩份樣品。

3 結(jié)果與討論

在本課題組前期[7]對(duì)人參皂苷UFLC-MS/MS研究的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，所有分析物均在負(fù)離子模式下有最大的響應(yīng)。各分析物優(yōu)化得到的保留時(shí)間、離子對(duì)信息、Q1能量、碰撞能量、Q3能量和滯留時(shí)間信息見(jiàn)表1。

表1 24個(gè)分析物保留時(shí)間及最優(yōu)離子化參數(shù)

分別對(duì)分析方法的專屬性、系統(tǒng)適用性、線性、定量下限和檢測(cè)下限、重復(fù)性、提取回收率和穩(wěn)定性進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法能夠用于上述24個(gè)分析物的含量測(cè)定[8]。(數(shù)據(jù)略)。

圖1為水超聲法提取人參飲片得到的MRM疊加圖，圖2為水回流提取人參飲片得到的MRM疊加圖，根據(jù)建立的UFLC-MS/MS對(duì)兩種提取物的定量分析結(jié)果總結(jié)見(jiàn)表2。

圖1 水超聲提取樣品中24個(gè)分析物的MRM疊加圖

圖2 水回流提取樣品中24個(gè)分析物的MRM疊加圖

常規(guī)上，如果將中藥粉末置于水中在常溫下提取，獲得的基本上是天然的原形化合物；而熱水回流提取可能得到人工產(chǎn)物。一般來(lái)說(shuō)，人參中的原人參二醇型(protopanaxadiol，PPD)達(dá)瑪烷四環(huán)三萜在C-3或C-20結(jié)合糖鏈，天然者的手性C-20呈S型；原人參三醇型(protopanaxatriol，PPT)達(dá)瑪烷四環(huán)三萜在C-6或C-20結(jié)合糖鏈，天然者的手性C-20呈S型。表2定量分析結(jié)果表明，室溫下超聲提取，人參飲片中化合物3[20(S)-G-Rh1]、4[20(S)-G-Rg2]等收率較低，但熱回流的情況下其收率上揚(yáng)。同時(shí)也可以觀察到，人參飲片中不含有它們的C-20差向異構(gòu)體(epimer)，即化合物5[20(R)-G-Rg2]和7[20(R)-G-Rh1]，但在熱回流的情況下出現(xiàn)了化合物5和7，此已被許多研究所證實(shí)，即在人參加熱提取或煎煮處理中，天然的20(S)型PPD和/或PPT達(dá)瑪烷四環(huán)三萜易向20(R)型差向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化的結(jié)果不僅表現(xiàn)在它們?nèi)芙舛壬系母淖?，而且?duì)其生物活性具有很大影響[2]，如表3所示的某些達(dá)瑪烷四環(huán)三萜對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

表2 不同提取方法人參提取物中人參皂苷的含量 mg·g-1

注：—表示未檢測(cè)到。

表3 某些達(dá)瑪烷四環(huán)三萜對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性 μmol·L-1

表2結(jié)果顯示，化合物5、7、11～24不存在于人參飲片中，但在熱回流處理人參飲片的情況下，這些化合物出現(xiàn)了?；衔?(G-Re)、2(G-Rb1)、6(G-Rc)、8(G-Rb2)、9(G-Rb3)和10(G-Rd)是生曬參中普通化合物[1，9-10]，除G-Rd外，它們應(yīng)該是人參中的天然化合物，G-Rd很可能是天然人參皂苷生物合成的中間體或降解產(chǎn)物，有待研究證實(shí)。根據(jù)表2的檢測(cè)結(jié)果和化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，推測(cè)PPD型人參皂苷可能通過(guò)熱致活化水提供的能量促進(jìn)糖苷鍵斷裂，發(fā)生非酶促反應(yīng)，產(chǎn)生一系列降解產(chǎn)物，見(jiàn)圖3。G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc等作為起始物逐級(jí)降解，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣性的降解產(chǎn)物。

從表2結(jié)果也可看出，隨著煎煮，G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc等的收量也在提高，可能來(lái)源于G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3、G-Rs1、G-Rs2、G-Rs3[1]，丙二?；藚⒃碥?malonylginsenoside，MG)Rb1、Rb2、Rc等。作為PPT型人參皂苷可能通過(guò)熱致活化水提供的能量促進(jìn)糖苷鍵斷裂，發(fā)生非酶促反應(yīng)，產(chǎn)生一系列降解產(chǎn)物，見(jiàn)圖4。典型的降解反應(yīng)，如從G-Re開(kāi)始等，產(chǎn)生少糖基的稀有人參皂苷(rare ginsenoside)。

圖3 水煎煮所致PPD型人參皂苷的可能降解途徑

圖4 煎煮所致PPT型人參皂苷的可能降解途徑

4 討論

人參中的G-Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1等稱之為普通人參皂苷，存在于生曬參中。而目前將它們的降解、少糖基產(chǎn)物稱之為稀有人參皂苷，如G-Rg5、Rh1、Rh2、Rh3、Rh4、Rk1、Rk2、Rk3等。由于稀有人參皂苷較普通人參皂苷的糖基少，脂溶性相對(duì)增強(qiáng)，相對(duì)易于滲透組織器官或細(xì)胞，容易到達(dá)“靶點(diǎn)”發(fā)揮作用。在SIRT1(silent information regulator two homologue 1)模型研究中，以G-Rb1為例，在10、20 μmol·L-1對(duì)SIRT1活性無(wú)激活作用，而其降解產(chǎn)物稀有人參皂苷20(S)-G-Rg3、20(R)-G-Rg3、G-Rg5[11]以及20(S)-PPD和20(R)-PPD[12]具有較強(qiáng)的SIRT1激活作用；在PPT型皂苷中，以G-Re為例，在10、20 μmol·L-1對(duì)SIRT1活性無(wú)激活作用，而其降解產(chǎn)物稀有人參皂苷G-F4、G-Rh4[11]以及20(S)-PPT和20(R)-PPT[12]具有較強(qiáng)的SIRT1激活作用，且有不同的藥代動(dòng)力學(xué)行為[13-15]，無(wú)論是PPD型還是PPT型人參皂苷，總體趨勢(shì)是糖基越少SIRT1激活活性越強(qiáng)?，F(xiàn)代研究表明，SIRT1尤其是SIRT3與線粒體的能量代謝密切相關(guān)，此與人參傳統(tǒng)功效的“大補(bǔ)元?dú)狻币恢?，提示其可能是人參延緩衰老的作用物質(zhì)。普通人參皂苷向稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化，改變了普通人參皂苷的活性[16]。如在臨床上，更善于用紅參治療癌癥。人參經(jīng)過(guò)煎煮，G-Rg3含量大幅上升，G-Rg3已應(yīng)用于臨床治療癌癥。

稀有人參皂苷的作用也是多方面的，但近年在癌癥、心腦血管疾病、肺纖維化疾病以及延緩衰老等方面的研究相對(duì)較多[2，17-21]，有了相關(guān)的抗癌產(chǎn)品。構(gòu)效關(guān)系研究[22-23]表明，某些稀有人參皂苷的抗癌細(xì)胞增殖大致有如下趨勢(shì)：G-Rk2≈G-Rh3>G-Rh2>G-Rk1≈G-Rg5>G-Rg3>G-Rh1，而Δ20，21PPD≈Δ20，22PPD>Δ20，21PPT≈Δ20，22PPT。有關(guān)不同稀有人參皂苷抗不同癌細(xì)胞增殖，資料公布的上海藥明康德合同研究組織(Contract Research Organization；CRO)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4，具有一定的先導(dǎo)性。對(duì)人參地上部分化學(xué)物質(zhì)的研究[12，22，24-27]提示含有更豐富的稀有人參皂苷。

人參方藥熱水煎煮，由水分子提供的活化能使人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生的稀有人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性更豐富，體現(xiàn)了人參生物活性的多樣性。從對(duì)紅參化學(xué)成分的研究[4，7，21]，也佐證了人參水煎煮的科學(xué)內(nèi)涵，而與用70%乙醇水溶液提取具有明顯的區(qū)別[28]。

表4 上海藥明康德CRO測(cè)試的某些稀有人參皂苷的細(xì)胞毒活性結(jié)果 μmol·L-1