西藏林芝散養(yǎng)藏雞新城疫抗體ELISA檢測分析

陳家露，蔡重振，扎西卓瑪，甘富斌，索朗斯珠，羅潤波*

(1.西藏農(nóng)牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏林芝市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧獸醫(yī)總站，西藏 林芝 860000；3.西藏林芝市巴宜區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，西藏 林芝 860000)

雞新城疫（Newcastle disease,ND），俗稱亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（NDV）強毒所引起的雞和多種禽類的高度接觸性傳染病，易感禽類常呈現(xiàn)敗血經(jīng)過。其傳播速度快、四季皆發(fā)、死亡率高，對禽類養(yǎng)殖戶造成嚴重的威脅與損失。20世紀80年代以來，由于疫苗的廣泛使用和各種生物安全措施的不斷提高，我國新城疫的流行得到了一定的控制，但無法做到全面免疫，同時免疫失敗的現(xiàn)象屢有發(fā)生[1-2]，導致該病在我國也有流行。藏雞作為高原特有品種，具有普遍散養(yǎng)、活動性強、抵抗力強等特點，雖然未見發(fā)病的報道，但仍然是新城疫的易感動物。為了解西藏林芝市散養(yǎng)藏雞群新城疫的流行情況，課題組于2018年10月在西藏林芝市巴宜區(qū)藏雞散養(yǎng)戶中隨機采集藏雞血液并提取血清，定性檢測新城疫抗體。以期對藏雞新城疫的防控提出合理建議。

1 試驗材料

1.1 儀器與試劑

無菌采血針、真空采血管、離心機（型號HD2-4）購自鴻科科技、高精度加樣槍：0.5～ 10μl、10～ 100μl、200～ 1 000μl高精度加樣排槍：10～100μl均購自德國艾本德股份公司、恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀(型號RT-2100C)購自深圳雷杜生命科學股份有限公司、雞新城疫抗體ELISA試劑檢測盒(批號HLE60097)由上海哈靈生物技術有限公司生產(chǎn)。

1.2 血樣的采集

在西藏林芝市周邊散養(yǎng)藏雞戶中隨機抽樣，采取翅下靜脈血液，每羽3～4 ml，冷藏并于2 h內(nèi)送回實驗室[3]。

1.3 血樣的處理

將所取全血在有血清析出時置于離心機中以3 000r/min，離心10 min，取上清液置于1.5 ml無菌EP管并進行編號，放置4℃冰箱備用。

2 試驗方法與判斷

2.1 試驗方法

將冷藏試劑盒取出置于室溫平衡20 min后，在 H9、H10孔中加入陽性對照50μl；H11、H12孔中加入陰性對照50μl；其余孔中依次加入待檢血清，各10μl；再加入樣本稀釋液各40μl。在所有樣本孔與陰、陽性對照孔中加入辣根過氧化酶 (HRP)標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱溫育1 h。在吸水紙上拍干廢液后加入洗滌液，靜置1 min后再拍干，如此反復5次洗滌過程。每孔加入底物TMB各50μl，37℃避光溫育15 min；最后加入終止液50μl，15 min測定其OD450nm值。

2.2 結(jié)果判斷

在陽性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15時判定試驗結(jié)果有效。當待檢血清OD值＜臨界OD值(臨界OD值＝陰性對照孔OD值平均值+0.15)時判定為陰性；反之為陽性。

3 試驗結(jié)果與討論

本次共計分離得到藏雞血清92份，根據(jù)酶標儀顯示陽性對照孔的平均OD值為1.1785(＞1.00)；陰性對照孔的平均OD值為0.0955(＜0.15)；表明本次試驗結(jié)果有效。計算得出臨界OD值為0.2455(臨界OD值＝陰性對照孔OD值平均值+0.15)，92份藏雞血清OD值均小于臨界OD值，表明本次所檢測的藏雞血清中均無新城疫抗體陽性。具體試驗結(jié)果見表1。

表1 92份藏雞血清新城疫抗體ELISA檢測試驗結(jié)果

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測新城疫抗體是目前應用最廣泛的一種方法，在ND的檢測中體現(xiàn)了操作簡便、檢測量大、敏感性好的優(yōu)點[4]。課題組通過ELISA試劑盒的運用，對散養(yǎng)藏雞的新城疫抗體檢測發(fā)現(xiàn)92份散養(yǎng)藏雞血清中并未檢測出新城疫抗體，這可能是由于西藏林芝市散養(yǎng)藏雞并未感染新城疫或未接種新城疫疫苗，同時也可能是免疫維持期已過。通過課題組走訪調(diào)查西藏林芝市巴宜區(qū)藏雞散養(yǎng)戶，發(fā)現(xiàn)散養(yǎng)藏雞并未接種新城疫疫苗。表明在此地區(qū)散養(yǎng)藏雞中無新城疫的流行。

有學者對西藏林芝市某雞場新城疫抗體檢測發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)雞免疫合格[5]。課題組通過檢測發(fā)現(xiàn)散養(yǎng)藏雞中無新城疫的流行。因此建議林市散養(yǎng)藏雞戶，建立嚴格的衛(wèi)生管理制度，防止外來雞帶入病毒感染本地藏雞，同時防止人員、來訪客、飼養(yǎng)用具等雜物的間接傳播，要嚴格執(zhí)行衛(wèi)生消毒管理制度。

散養(yǎng)藏雞新城疫免疫應結(jié)合實際制定科學的免疫措施，并根據(jù)林芝當?shù)匾卟×餍星闆r、飼養(yǎng)類型、母源抗體效價等具體情況來確定免疫時機與次數(shù)；一般以6～10日齡首次接種為宜，15天后進行二次免疫[6-7]；同時，要按照要求進行監(jiān)測，建立和完善新城疫監(jiān)測系統(tǒng)。