臨床患者檢測(cè)卡馬西平藥物基因位點(diǎn)在預(yù)防Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥中的應(yīng)用*

程曉東，張 瑩，胡玉皎，王 昊，周鐵成，郝曉柯

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)中心，西安 710032)

卡馬西平(carbamazepine，CBZ)是精神運(yùn)動(dòng)性癲癇的首選藥物，也可用于抗驚厥、抗神經(jīng)性疼痛、抗躁狂-抑郁癥等疾病的治療。但是通過對(duì)中國(guó)漢族患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，Steven-Johnson綜合征(steven johnson syndrome，SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生與使用卡馬西平以及患者體內(nèi)攜帶人白細(xì)胞抗原(HLA)-B*1502等位基因的突變存在著很強(qiáng)的相關(guān)性，HLA-B*1502是卡馬西平誘導(dǎo)SJteven-Tohnson綜合征/中毒性表皮壞死松解癥已知的生物學(xué)標(biāo)志物[1-2]，因此首次使用卡馬西平的患者在治療前應(yīng)進(jìn)行HLA-B*1502等位基因的篩查。

本文使用數(shù)字化熒光檢測(cè)儀和熒光染色原位雜交，實(shí)現(xiàn)小片段測(cè)序和SNP分型，對(duì)卡馬西平耐藥位點(diǎn)HLA-B*1502TA(C>G)和HLA-B*1502TB(C>T)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同患者的基因型特性進(jìn)行合理用藥，達(dá)到提高藥效、避免或減少毒副作用和不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，為使用卡馬西平藥物的患者提供精準(zhǔn)的用藥指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 我院2016年8月～2018年12月接受卡馬西平耐藥位點(diǎn)HLA-B*1502TA(C >G)和HLA-B*1502TB(C>T)檢測(cè)的患者148例，其中男性62例，女性86例，平均年齡57.05±15.30歲。

1.2 試劑和儀器 試劑：10×NH4Cl預(yù)處理液，處理血液樣本時(shí)用于裂解紅細(xì)胞；耀金保(核酸純化試劑)，用于在進(jìn)行SNP分析前對(duì)標(biāo)本進(jìn)行保存；耀金分(測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒)，數(shù)字熒光分子雜交實(shí)驗(yàn)和化學(xué)藥物用藥指導(dǎo)項(xiàng)目的樣本分析試劑；軟件設(shè)定液，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；陽性對(duì)照監(jiān)測(cè)儀器狀態(tài)是否在控。所有試劑購于北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司。

儀器：熒光檢測(cè)儀(西安天隆科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)樣本：靜脈全血，使用EDTA抗凝紫帽管采集，4℃低溫保存，保存時(shí)間不宜超過24 h。

1.3.2 標(biāo)本前處理：在1.5 ml離心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl預(yù)處理液，吸取200 μl混勻的全血，室溫靜置5～10 min，紅細(xì)胞完全破裂，離心管中液體變?yōu)槌吻宓募t色后離心5 min。

吸取上層透明的紅色液體后，向管底富集的白細(xì)胞團(tuán)塊中加入30 μl耀金保使白細(xì)胞的胞膜破裂。充分混勻，為了更好地使細(xì)胞核內(nèi)的核酸游離出來，室溫靜置30～60 min，等待檢測(cè)。

1.3.3 檢測(cè)過程：樣本檢測(cè)：吸取1.5 μl處理后的白細(xì)胞樣本加到相應(yīng)的試劑中上機(jī)檢測(cè)。陽性對(duì)照：吸取1.5 μl的陽性質(zhì)控品分別加到對(duì)應(yīng)的軟件設(shè)定液中。陰性對(duì)照：吸取1.5 μl耀金保保存液，加到試劑中。

1.3.4 質(zhì)控結(jié)果分析：陰性對(duì)照用以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室和前處理過程中是否存在污染，檢出結(jié)果應(yīng)為“重測(cè)”；陽性對(duì)照用以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裾z出陽性標(biāo)本，檢出結(jié)果應(yīng)為陽性質(zhì)控品的基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 收集記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，錄入SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。定性資料以百分率(%)表示，P<0.05為對(duì)比組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05為對(duì)比組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 卡馬西平化學(xué)藥物基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果 HLA-B*1502TA(C>G)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為CC的患者126例，占總?cè)藬?shù)的85.14%；檢測(cè)結(jié)果為CG的患者21例，占總?cè)藬?shù)的14.19%；檢測(cè)結(jié)果為GG的患者1例，占總?cè)藬?shù)的0.67%。HLA-B*1502TB(C>T)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為CC的患者109例，占總?cè)藬?shù)的73.65%；檢測(cè)結(jié)果為CT的患者37例，占總?cè)藬?shù)的25.00%；檢測(cè)結(jié)果為TT的患者2例，占總?cè)藬?shù)的1.35%，HLA-B*1502TA(C>G)位點(diǎn)與HLA-B*1502TB(C>T)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.855，P=0.192)。

2.2 卡馬西平化學(xué)藥物各個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果對(duì)臨床的指導(dǎo) 見表1。對(duì)于HLA-B*1502基因，HLA-B*1502TA(C>G)和HLA-B*1502TB(C>T)基因均為野生型時(shí)，卡馬西平類藥物可以使用；HLA-B*1502TA(C >G)和HLA-B*1502TB(C > T)基因有雜合突變型基因58例(38.19%)，卡馬西平類藥物慎用；任何一個(gè)耐藥位點(diǎn)突變成純合突變，無論另一個(gè)耐藥基因是野生型、雜合突變、純合突變，卡馬西平類藥物均為禁用。

表1 卡馬西平化學(xué)藥物各個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果對(duì)臨床的指導(dǎo)

3討論卡馬西平主要被肝臟的酶催化代謝成各種代謝產(chǎn)物，其中芳羥氧化物需被肝臟產(chǎn)生的環(huán)氧化物水解酶水解后才能由腎臟排出。若藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶功能缺陷，藥物在體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物就不能被正常排出體外，這些代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞毒性作用主要發(fā)生在Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥的早期。Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥是同一種疾病的不同階段，根據(jù)疾病所累及的皮膚和黏膜的面積進(jìn)行分類，剝脫皮膚的體表面積小于10%的患者稱Steven-Johnson綜合征；剝脫皮膚的體表面積大于30%的患者稱中毒性表皮壞死松解癥；剝脫皮膚的體表面積介于10%～30%之間的患者稱重疊的Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥。Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥的風(fēng)險(xiǎn)與使用卡馬西平以及患者體內(nèi)攜帶(HLA)-B*1502等位基因的突變存在很強(qiáng)的相關(guān)性，且具有種族差異性。HLA基因是人類目前已知的最復(fù)雜的基因，位于人類染色體6p21.3。HLA基因是由一組緊密連鎖的復(fù)等位基因位點(diǎn)組成，具有高度多態(tài)性，主要功能是將藥物及其代謝產(chǎn)物包裝，呈遞給T細(xì)胞，使T胞活化，細(xì)胞毒性T細(xì)胞使自身淋巴細(xì)胞或皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生死亡。目前已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥密切相關(guān)的HLA基因，HLA-B*1502等位基因的相關(guān)性最強(qiáng)[6]。

通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)，不僅中國(guó)漢族患者使用卡馬西平治療后Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生與體內(nèi)攜帶(HLA)-B*1502等位基因的突變存在著很強(qiáng)的相關(guān)性[3]，馬來西亞、泰國(guó)、新加坡等國(guó)家[4-5，7]的學(xué)者對(duì)這些國(guó)家的患者進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)HLA-B*1502等位基因的突變不僅增加了Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥的風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)發(fā)生嚴(yán)重皮膚藥物反應(yīng)以及藥物誘導(dǎo)的過敏皮疹伴嗜酸性粒細(xì)胞增多和全身癥狀，HLA-B*1502也被稱作是公認(rèn)的疤痕風(fēng)險(xiǎn)因素。

有學(xué)者研究了27例使用卡馬西平治療的亞洲癲癇患者，其中6例患者患有卡馬西平誘發(fā)的Steven-Johnson綜合征，11例患者患有卡馬西平誘發(fā)的皮疹。對(duì)HLA-B*1502基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，6例Steven-Johnson綜合征患者HLA-B*1502基因檢測(cè)結(jié)果陽性；另外11例患有卡馬西平誘發(fā)皮疹的患者中，有4例患者HLA-B*1502基因檢測(cè)結(jié)果陽性。進(jìn)一步證明對(duì)于亞洲人群，Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥的風(fēng)險(xiǎn)與使用卡馬西平以及患者體內(nèi)攜帶(HLA)-B*1502等位基因的突變存在很強(qiáng)的相關(guān)性[7]。通過研究漢族和白種人HLA-B*1502陽性的患者淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)，中國(guó)人淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)均為陰性，而白種人患者均為陽性。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示不同種族背景患者卡馬西平誘導(dǎo)的不同超敏反應(yīng)的機(jī)制途徑不止一個(gè)，而漢族人與HLA-B*1502等位基因的陽性結(jié)果強(qiáng)相關(guān)[8]。所以對(duì)于我國(guó)患者，首次使用卡馬西平治療前應(yīng)進(jìn)行HLA-B*1502等位基因的篩查。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)準(zhǔn)備使用卡馬西平治療的148例患者進(jìn)行HLA-B*1502TA(C >G)基因位點(diǎn)檢測(cè)。HLA-B*1502TA(C >G)基因純合突變的患者3例，這類患者禁止使用卡馬西平以及卡馬西平類藥物，這類患者發(fā)生Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥的風(fēng)險(xiǎn)極高。HLA-B*1502TA(C >G)基因雜合突變的患者58例，這類患者慎用卡馬西平以及卡馬西平類藥物，患者具有發(fā)生Steven-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥以及卡馬西平誘發(fā)皮疹的風(fēng)險(xiǎn)，在療效大于風(fēng)險(xiǎn)的條件下密切觀察用藥后的不良反應(yīng)?；颊咴谟盟幥斑M(jìn)行HLA-B*1502等位基因的篩查可以避免38.19%的患者發(fā)生卡馬西平相關(guān)Steven-Johnson綜合征、中毒性表皮壞死松解癥和卡馬西平誘發(fā)皮疹的發(fā)生，為患者提供安全的用藥指導(dǎo)。