鹽脅迫對燕麥葉片生理指標(biāo)和差異蛋白組學(xué)的影響

陳曉晶 劉景輝 楊彥明 趙 洲 徐忠山 海 霞 韓宇婷

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) / 內(nèi)蒙古雜糧工程技術(shù)研究中心 / 全國農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團(tuán)隊,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019

中國鹽漬土總面積9913 萬公頃,約占國土面積的 1.03%[1],全球大約20%的陸地面積和近一半的灌溉土地都受到鹽影響[2]。鹽漬化是全球面臨的嚴(yán)峻問題之一,也是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素,如何提高植物耐鹽性,充分利用鹽漬土已成為目前研究的重點(diǎn)。目前,蛋白組學(xué)分析已經(jīng)成為揭示鹽脅迫下表達(dá)差異的最佳策略之一。前人分析了鹽脅迫條件下水稻、小麥、玉米、大麥等植物不同組織器官細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組變化特征[3],并已經(jīng)在水稻[4-6]、小麥[7-8]等葉片中鑒定出404 種與鹽脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)。燕麥作為糧飼兼用作物,具有耐鹽堿、耐貧瘠、抗寒等特性,已成為改良鹽堿地的先鋒作物[9]。目前有關(guān)燕麥耐鹽性的研究主要集中在生理生化指標(biāo)、離子吸收及氣孔排鹽機(jī)制上[9-11],關(guān)于鹽脅迫對燕麥蛋白質(zhì)組學(xué)的影響鮮有報道[12]。在燕麥響應(yīng)逆境脅迫領(lǐng)域開展蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究,為新的抗逆基因(或蛋白)的鑒定奠定了基礎(chǔ)。非標(biāo)定量法(Label-Free)是近年來重要的質(zhì)譜定量方法,通過比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強(qiáng)度,分析不同來源樣品蛋白的數(shù)量變化來提高低豐度蛋白質(zhì)的檢測效率和蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)運(yùn)用Label-Free 技術(shù),對比研究對照與處理間差異蛋白的變化及涉及的功能,旨在挖掘響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的蛋白,明確參與燕麥耐鹽過程的相關(guān)代謝通路,為作物抗鹽育種提供更有效地科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

2017—2018年,在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)燕麥產(chǎn)業(yè)研究中心溫室,選用吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的白燕5 號開展盆栽試驗(yàn)。設(shè)對照(BYC)及鹽脅迫(BYS)2 個處理,每10 桶為一次重復(fù),每個處理重復(fù)3 次,共60 桶。每桶播30 粒種子至裝滿配置基質(zhì)(沙土∶蛭石∶陶粒 = 3∶1∶2)的塑料桶(桶上徑24 cm、下徑22 cm、高25 cm),出苗后間苗至20株。每桶底部鉆5 個直徑4 mm 圓孔滲水透氣。每周澆Hogland 營養(yǎng)液3 次,每次250 mL。于燕麥三葉期對燕麥進(jìn)行150 mmol L-1鹽脅迫處理(按摩爾濃度NaCl∶Na2SO4= 1∶1 混合溶于營養(yǎng)液)6 d,對照澆相同體積營養(yǎng)液,在燕麥分蘗期分別取BYC 與BYS 處理各重復(fù)倒三葉葉片共2 g 至1.5 mL凍存管中,液氮速凍,-80℃保存用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.2 常規(guī)指標(biāo)測定與方法

采用硫代巴比妥酸法[13]測定丙二醛(MDA)含量；用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定[14]超氧化物歧化酶(SOD)活性；用愈創(chuàng)木酚法測定[13]過氧化物酶(POD)活性；用磺基水楊酸提取法[15]測定游離脯氨酸(Pro)含量。

1.3 燕麥葉片總蛋白的提取

將凍存待測的樣本用液氮預(yù)冷的粉碎器粉碎。用液氮研磨粉碎后的粉末。將粉末按照1∶10(w/v)加入Lysis buffer 渦旋混勻。以0.2 s on、2 s off,振幅22%超聲60 s。室溫提取30 min。15,000 ×g10℃離心1 h,取上清液,分裝后凍存于-80℃。

1.4 蛋白定量

采用Bradford 法[16]測定樣本所提取的蛋白濃度。根據(jù)曲線公式計算各樣品蛋白濃度(μg μL-1)。具體操作步驟見程德金等[17]的研究。

1.5 蛋白酶解(filter aided sample preparation,FASP)

蛋白定量后取200 μg蛋白溶液置于離心管。加入DTT,使終濃度為25 mmol L-1,60℃反應(yīng)1 h。加入碘乙酰胺,使終濃度為50 mmol L-1,室溫10 min。將還原烷基化后的蛋白溶液加入10 K 超濾管,12,000 ×g離心20 min,棄掉收集管底部溶液。加入Dissolution buffer 100 μL,12,000 ×g離心20 min,棄掉收集管底部溶液,重復(fù)3 次。更換新的收集管,在超濾管中加入胰蛋白酶,總量4 μg(與蛋白質(zhì)量比為1∶50),體積50 μL,37℃反應(yīng)過夜。次日,12,000 ×g離心20 min,酶解消化后的肽段溶液離心收集于管底部。在超濾管中加入50 μL Dissolution buffer,12,000 ×g再次離心20 min,與上步合并,收集管底部共得到100 μL酶解后的樣品。凍干待上樣。

1.6 納升級反相色譜-Q Exactive 進(jìn)行蛋白質(zhì)分析

將高 pH 反相分離得到的組份用20 μL 2%甲醇和0.1%甲酸復(fù)溶。12,000 ×g離心10 min,吸取上清液上樣。上樣體積10 μL,采取夾心法上樣。Loading Pump 流速350 nL min-1,15 min。分離流速300 nL min-1。

1.7 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

使用數(shù)據(jù)庫uniprot-Pooideae361804_20170619.fasta.fasta(362,934 sequences)。質(zhì)譜分析是由Thermo Q Exactive 型質(zhì)譜完成,可信度在 95%以上的譜肽(Peptide Spectrum Matches,簡稱PSMs)為可信PSMs,至少包含一個unique 肽段(特有肽段)的蛋白為可信蛋白,只保留可信的譜肽和蛋白,并做FDR 驗(yàn)證,去除FDR 大于1%的肽段和蛋白。在比較的樣品對之間,將蛋白在不同重復(fù)組中差異倍數(shù)的均值作為2 個樣品的差異倍數(shù),并做T-test 檢驗(yàn)得到P-value,以此作為顯著性指標(biāo)。

1.8 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

采用Microsoft Excel 2003 和SAS 9.0 軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。對鑒定到的蛋白進(jìn)行常見功能數(shù)據(jù)庫注釋,包括COG、GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫；最后針對篩選出來的差異蛋白進(jìn)行GO、KEGG 功能富集分析等一系列的差異蛋白功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對游離脯氨酸、抗氧化酶活性、及丙二醛的影響

MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,是細(xì)胞膜穩(wěn)定性的標(biāo)志物；SOD 和POD 在活性氧(ROS)清除中起重要作用；植物體內(nèi)Pro 含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,由圖1可知,BYS 處理的MDA、SOD 活性均呈下降趨勢,分別較BYC 降低16.7%和23.4%,但無顯著差異。POD 較BYC 顯著降低21.2%,Pro 含量變化不明顯,較BYC升高了1.12%。

2.2 鹽脅迫下差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選

在相對定量時,將兩個樣品蛋白豐度比定義為差異倍數(shù)。本研究以蛋白質(zhì)差異倍數(shù)大于2 且經(jīng)統(tǒng)計檢驗(yàn)其P-value值小于0.05 時,視為上調(diào)蛋白；以差異倍數(shù)小于0.5 且經(jīng)統(tǒng)計檢驗(yàn)其P-value 值小于0.05 時,視為下調(diào)蛋白。將BYS 和BYC 比較,得到差異表達(dá)蛋白76 個,其中51 個蛋白上調(diào)表達(dá),25 個蛋白下調(diào)表達(dá)。對每個蛋白差異倍數(shù)以2 為底取對數(shù)后作出分布如圖2,表達(dá)量上調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0 位置的右側(cè),表達(dá)量下調(diào)的蛋白居于橫坐標(biāo)0位置的左側(cè)。

2.3 鹽脅迫下差異表達(dá)蛋白質(zhì)聚類分析

由圖3可知,不同蛋白在不同樣品間的上調(diào)、下調(diào)情況,且兩組樣品中3 次重復(fù)樣品間的相似性極高,說明篩選差異蛋白的合理性；76 個差異蛋白通過COG 數(shù)據(jù)庫有62 個差異蛋白可被注釋并進(jìn)行功能分類(表1)。

圖1 鹽脅迫對抗氧化酶活性的影響 Fig.1 Effect of salt stress on antioxidant enzyme activity

圖2 差異蛋白火山圖 Fig.2 Differential protein volcano map

圖3 差異蛋白聚類熱圖 Fig.3 Differential protein clustering heat map

表1 BYC 與BYS 差異蛋白 Table1 BYC and BYS differential proteins

(續(xù)表1)

2.4 GO 注釋與GO 富集分析

如圖4所示,對76 個差異蛋白通過GO 注釋到27 個,顯著富集 16 個代謝路徑,主要表現(xiàn)在氧化還原過程(oxidation-reduction process)33.9%；氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)28.6%；氧化還原酶活性,作用于供體的 CH-OH 基團(tuán),NAD 或 NADP 作為受體(oxidoreductase activity,acting on the CH-OH group of donors,NAD or NADP as acceptor)7.1%；未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合(unfolded protein binding)5.4%。從細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)以及生物過程(biological process)這三個方面分類,在細(xì)胞組分沒有成分發(fā)生變化；分子功能有10 個成分發(fā)生變化,其中l(wèi)evel 3 統(tǒng)計富集的生物學(xué)過程有2 個,分別為氧氣結(jié)合(oxygen binding)和氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)；生物過程有6 個成分發(fā)生變化。

圖4 差異蛋白GO 富集結(jié)果 Fig.4 Differential protein GO enrichment results

2.5 KEGG 注釋與KEGG 富集分析

在鹽脅迫過程中,蛋白功能的行使是依靠多個蛋白的協(xié)同作用,導(dǎo)致大量蛋白發(fā)生明顯變化。而通路分析可以更全面、更系統(tǒng)地了解每個蛋白的生物學(xué)過程及應(yīng)對鹽脅迫的機(jī)制。通過KEGG 富集,76 個差異蛋白中有22 個差異蛋白顯著富集10個生化代謝途徑,如圖5所示,分別為β-丙氨酸代謝(beta-Alanine metabolism)、長壽調(diào)節(jié)途徑(Longevity regulating pathway-multiple species)、抗原處理和呈現(xiàn)(Antigen processing and presentation)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、維生素B6代謝(Vitamin B6 metabolism)、氯代烷烴和氯代烯烴降解(Chloroalkane and chloroalkene degradation)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、檸檬烯和蒎烯降解(Limonene and pinene degradation)、沙門氏菌感染(Salmonella infection),且Protein processing in endoplasmic reticulum、 Longevity regulating pathway-multiple species、Antigen processing and presentation 和Estrogen signaling pathway 這4 個途徑在鹽脅迫條件下發(fā)生了非常顯著變化。

2.6 差異蛋白質(zhì)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

76個差異蛋白通過String在線軟件(http：//www.string- db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)互相作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并隱藏沒有相互作用的蛋白,得到21 個差異蛋白共建立50 種互作關(guān)系,如圖6所示,與蛋白質(zhì)F2DYT5 互作的蛋白數(shù)最多,有6個；有4 個蛋白質(zhì)與F4Y589 和A0A1D5SA32 互作；均有3 個蛋白質(zhì)與 I1GZ93、I1GU32、W5EGU4、I1IF07、M0Y631、A0A1D5Y3B7 互作；2 個蛋白質(zhì)與A9LIN4、I1IU29、A0A1D5S6L5、I1J3C6、Q3I0N4、F2E3N4 互作；僅有一個與之互作的蛋白質(zhì)有I1GM81、A0A1D6AN16、O65195、Q8S311、G8CLP1 和I1HU73。

3 討論

植物抗鹽性指標(biāo)是研究植物抗鹽機(jī)理和能力的基礎(chǔ),MDA 間接表示膜受損狀況,且有反饋?zhàn)饔肹18]。高彩婷等[19]發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫24 h 燕麥葉片MDA 含量最高,之后迅速下降。本研究鹽脅迫6 d MDA 含量下降,可能是長時間脅迫造成的。SOD、POD 在植物體內(nèi)活性氧清除過程中起重要作用[20]。周瑩等[21]研究表明,SOD 活性隨NaCl 濃度升高呈先增后降趨勢,POD 活性呈逐漸下降趨勢。本試驗(yàn)中,150 mmol L-1為燕麥忍受鹽脅迫的臨界濃度[22],SOD、POD 活性均降低,與前人研究結(jié)果一致,且SOD 活性的變化規(guī)律也反映了與其相關(guān)蛋白I1I9J4 的表達(dá)情況,在鹽脅迫下呈下調(diào)表達(dá)。前人研究表明草木樨幼苗在NaCl 脅迫下,產(chǎn)生更多的Pro 維持細(xì)胞滲透平衡[23]。本試驗(yàn)與其結(jié)果一致,鹽脅迫下燕麥葉片Pro 含量增加。

通過比較CK與鹽脅迫處理蛋白質(zhì)變化,共鑒定到76個差異蛋白,通過GO 顯著富集16 個代謝途徑,KEGG 顯著富集10 個代謝途徑；COG 數(shù)據(jù)庫注釋得到62 個差異蛋白分屬于不同蛋白質(zhì)家族,包含11 個豐富的代謝途徑,這與ZHAO[24]研究結(jié)果相似。其中翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶等功能包含最多的差異蛋白質(zhì),為15 個,且除M0Y631 外全部上調(diào)。蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)圖表明大部分蛋白來自這一代謝途徑,表明鹽脅迫下燕麥通過合成大量蛋白來抵御逆境[25]。本研究鑒定的差異蛋白質(zhì)中,有9 個與分子伴侶相關(guān),4 個與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)相關(guān),2 個與蛋白質(zhì)翻譯后修飾相關(guān)。分子伴侶蛋白不僅對蛋白質(zhì)前體的轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用[26],還能調(diào)控蛋白質(zhì)折疊、積累及其定位和降解[27-30]。本研究鑒定的9 個分子伴侶相關(guān)蛋白均屬熱激蛋白,在鹽脅迫條件下 8 個上調(diào),且與 F2DYT5、F4Y589 互作的蛋白數(shù)最多。Hamilton 等[31]研究發(fā)現(xiàn)玉米就是通過合成熱激蛋白應(yīng)對高鹽脅迫對其造成的傷害。Ribosomal 是蛋白質(zhì)合成的主要“工廠”,在mRNA 翻譯成多肽的過程中起重要作用[12]。本試驗(yàn)中F2DBP2 上調(diào),推測其與熱激蛋白的合成有關(guān)。

圖5 差異蛋白KEGG 富集結(jié)果氣泡圖 Fig.5 Bubble diagram of differential protein KEGG enrichment results

圖6 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)圖 Fig.6 Protein interaction network diagram