微生物發(fā)酵法制備富含γ-氨基丁酸的桑葉復(fù)合粉

陳佩珊　陳芳艷

微生物發(fā)酵法制備富含γ-氨基丁酸的桑葉復(fù)合粉

陳佩珊陳芳艷

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院廣東廣州510642）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）具有神經(jīng)傳遞、降血壓、利尿和鎮(zhèn)定等生理功能。為了開(kāi)發(fā)富含GABA的桑葉產(chǎn)品，文章在實(shí)驗(yàn)室中從桑葉分離篩選到的植物乳植菌SG-5作為發(fā)酵菌種，應(yīng)用于桑葉GABA的發(fā)酵富集，以桑葉為主要原料，開(kāi)展四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，得到最優(yōu)配方和最優(yōu)發(fā)件條件：最佳配方組合為葡萄糖2 %、蛋白胨8 %、K2HPO42.0 %和L-谷氨酸鈉 1.5 %，各配方成分影響主次順序從大到小依次為葡萄糖＞蛋白胨＞K2HPO4＞L-谷氨酸鈉；最優(yōu)發(fā)酵條件為溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，接種量5%，初始含水量60%，各發(fā)酵條件影響主次順序從大到小依次為培養(yǎng)溫度、接種量、初始含水量、培養(yǎng)時(shí)間。在此最優(yōu)條件下獲得發(fā)酵桑葉粉的 GABA含量為31.46 mg/g，蛋白質(zhì)含量為1.93 mg/g，總糖含量為34.13 mg/g，pH值為5.69。

桑葉粉；γ-氨基丁酸；植物乳桿菌；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA)是哺乳動(dòng)物神經(jīng)中樞的一種抑制性遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進(jìn)腦部血流等作用[1～4]。1959年，Elliott和Hobbiger通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明靜脈注射GABA可以使血壓下降[5]。而DianaM. 等人的研究結(jié)果表明通過(guò)飲食富含GABA的功能食品亦可降低和預(yù)防高血壓[6]。天然的GABA存在于蔬菜和水果等植物當(dāng)中，但是其含量很低，直接在食品中添加人工合成的GABA，不屬于天然產(chǎn)物，應(yīng)用有條件限制[7～9]。通過(guò)微生物發(fā)酵的方法來(lái)提高食品中GABA的含量是一種有效的途徑。可以發(fā)酵生產(chǎn)GABA的微生物有細(xì)菌、真菌和酵母[10～12 ]。這些菌能產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶（GAD），并催化谷氨酸合成GABA。其中乳酸細(xì)菌是人和動(dòng)物胃腸道中正常菌群，不僅具有抗菌、降低膽固醇、抑癌和增強(qiáng)免疫力等重要生物學(xué)功能，還可賦予食品特殊的風(fēng)味，是具有安全性的食品微生物[13]。

桑葉是桑科植物的葉子，桑樹(shù)在我國(guó)種植廣泛，生命力極強(qiáng)，資源豐富。桑葉主要作為養(yǎng)蠶，它也是傳統(tǒng)的中草藥。桑葉作為藥食兩用資源的記載如《神農(nóng)本草》《本草綱目》《中華人民共和國(guó)藥典》均有詳細(xì)的資料。20 世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)及國(guó)際上對(duì)桑樹(shù)等藥物的有效成分進(jìn)行大量的研究，明確其活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥用功能等如黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、甾醇類(lèi)、生物堿等，對(duì)這些活性物質(zhì)治療糖尿病、高血脂、高血壓的療效進(jìn)行了深入的研究[14～18 ]。隨著醫(yī)學(xué)及相關(guān)科學(xué)的發(fā)展，桑樹(shù)資源的醫(yī)用價(jià)值也得到進(jìn)一步拓展。本課題組研究桑葉的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)桑嫩葉的GABA含量較高。在此基礎(chǔ)上分離純化出GABA并且用于灌胃高血壓模型鼠，結(jié)果表明對(duì)高血壓大鼠起到降低血壓的作用。

為了提高桑嫩葉中GABA含量，達(dá)到開(kāi)發(fā)降血壓功能保健食品的目的，本研究將從桑葉中篩選分離出高產(chǎn)GABA桿物乳酸菌SG-5應(yīng)用于桑葉粉的固態(tài)發(fā)酵的研究，以期低成本獲得富含GABA桑葉粉，為今后開(kāi)發(fā)預(yù)防和控制高血壓的桑葉藥食產(chǎn)品提供原料，拓展桑葉在醫(yī)藥衛(wèi)生、保健食品等領(lǐng)域的新用途。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料：桑葉千目粉；試驗(yàn)菌株：SG-5菌株，從桑葉中分離純化得到；試劑：GABA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司，色譜純；MRS培養(yǎng)基；LaCl3，Na2CO3，NaHCO3，KOH等均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

取出冷凍的菌種，解凍后，挑取菌于MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后MRS固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出許多白色菌落，重復(fù)2次劃線，出現(xiàn)單個(gè)菌落。挑取單菌落接入裝有10 mLMRS液體培養(yǎng)基的離心管中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)8 h。8 h后離心管底部出現(xiàn)白色混濁，搖勻，按2 %接種量接入50 mLMRS培養(yǎng)基中于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h至混濁。7～8 h時(shí)菌體處于最活躍的狀態(tài)，故選擇接種種齡為7～8 h的SG-5菌加入桑葉粉中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方

配制固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，以桑葉粉為基質(zhì)，選擇葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，添加K2HPO4和L-谷氨酸鈉作為生長(zhǎng)因子。以發(fā)酵產(chǎn)物中GABA的含量為指標(biāo)，研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉4個(gè)主要因素對(duì)固體發(fā)酵的影響，進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方。按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表1安排實(shí)驗(yàn)。以10 g培養(yǎng)基為例，2 %葡萄糖即稱(chēng)量0.2 g葡萄糖加入到培養(yǎng)基中。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵條件的確定

發(fā)酵條件主要研究初始含水量、菌體接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)固體發(fā)酵的影響，以產(chǎn)GABA的含量為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)確定固體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件。按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表2安排實(shí)驗(yàn)。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 Berthelot比色法測(cè)定GABA的含量

參照陳恒文等的檢測(cè)方法，以不同濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。得到回歸方程為y=0.2283 x+0.0072 ，R2=0.9952 。

稱(chēng)取1 g樣品，放入50 mL三角瓶中，加入20 mL無(wú)菌蒸餾水和適量玻璃珠，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩2 h,轉(zhuǎn)速約為170～220 r/min。將震蕩后的渾濁液以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，測(cè)定樣品中GABA的含量。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定按Bradford的方法[20]。以不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=0.8243 x-0.001 ，R2=0.9932 。

稱(chēng)取1 g經(jīng)過(guò)干燥后的樣品，加入蒸餾水9 mL，以170 ～190 r/min震蕩30 min，過(guò)濾取濾液測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

1.2.6 總糖含量的測(cè)定

采用蒽酮比色法測(cè)定總糖含量[21]。以不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=0.3178 x+0.0046 ，R2=0.9947 。

稱(chēng)取1 g干燥后樣品，加入1.25 % HCL 100 mL，沸水浴2h，過(guò)濾取濾液用蒸餾水定容至100 mL備用，加I2-KI以防變色，取濾液測(cè)定總糖的含量。

1.2.7 pH值測(cè)定

取樣品1 g，加蒸餾水9 mL，于搖床上175 r/min震蕩30 min，過(guò)濾取濾液，用pH儀測(cè)定濾液pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定培養(yǎng)基配方

研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉4個(gè)主要因素對(duì)固體發(fā)酵的影響，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)，共9組試驗(yàn)號(hào)。以發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)GABA的量為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析見(jiàn)表4～表6，確定最佳培養(yǎng)基配方。

表3　培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　不同配方添加量對(duì)GABA產(chǎn)量影響的方差分析

表5　用鄧肯氏新復(fù)極差法測(cè)定葡萄糖添加量顯著性梯形表

表6　各成分添加量對(duì)GABA產(chǎn)量影響分析

正交試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，影響桑葉粉固態(tài)發(fā)酵配方的主次順序從大到小依次為葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉。葡萄糖添加量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響最為顯著，其影響為(見(jiàn)表5)：三個(gè)水平中葡萄糖增加量與GABA產(chǎn)量成反比。當(dāng)葡萄糖添加量為2 %時(shí)，GABA產(chǎn)量最高，且明顯大于添加量為6 %和10 %，葡萄糖添加量2 %時(shí)GABA產(chǎn)量的平均值是添加量10 %時(shí)的三倍。其次，表6可見(jiàn)蛋白胨添加量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響也較大，與葡萄糖添加量相反，隨著蛋白胨的增加，GABA產(chǎn)量也越來(lái)越高。K2HPO4添加量的影響次于蛋白胨添加量，最佳添加量為2.0 %。L-谷氨酸鈉添加量的影響最小，添加量在0.5 %和1.0 %時(shí)GABA產(chǎn)量并無(wú)多大差別。

分析結(jié)果得出培養(yǎng)條件的最佳組合為葡萄糖添加量2 %、蛋白胨添加量8 %、K2HPO42.0 %和 L-谷氨酸鈉 1.5 %。

2.2 確定發(fā)酵條件

研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸鈉4個(gè)主要因素對(duì)固體發(fā)酵的影響，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)，共9組試驗(yàn)號(hào)。以發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)GABA的量為指標(biāo)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表7）并進(jìn)行方差分析，確定固體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件。

表7　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表8　不同發(fā)酵條件對(duì)GABA產(chǎn)量影響的方差分析

表9　不同發(fā)酵條件對(duì)GABA產(chǎn)量影響的分析

正交試驗(yàn)(表8)結(jié)果表明，四個(gè)因素中，對(duì)影響桑葉粉固態(tài)發(fā)酵條件最大的是發(fā)酵溫度、接種量、初始含水量、發(fā)酵時(shí)間。表9可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度設(shè)定為30 ℃時(shí)，GABA產(chǎn)量明顯比發(fā)酵溫度設(shè)定為35 ℃和40 ℃時(shí)高，30 ℃的GABA平均產(chǎn)量幾乎是35 ℃時(shí)的兩倍。其次，接種量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響也較大，接種量與GABA平均產(chǎn)量不成線性關(guān)系。接種量為5 %時(shí)，GABA產(chǎn)量最高。初始含水量的影響次于接種量，最佳添加量為60.0 %。發(fā)酵時(shí)間的影響GABA產(chǎn)量最不顯著，GABA產(chǎn)量平均值差別不大。

分析結(jié)果得出固態(tài)培養(yǎng)基配方的最佳組合：發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為36 h，接種量5 %，初始含水量60 %。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物主要成分及pH值測(cè)定

發(fā)酵后的桑葉粉細(xì)粉末呈棕綠色，較松軟，散發(fā)出發(fā)酵酸菜的氣味，而發(fā)酵液氣味較清香。對(duì)富含 γ-氨基丁酸桑葉粉發(fā)酵產(chǎn)物中的主要成分進(jìn)行測(cè)定，測(cè)出在最佳配方及最佳培養(yǎng)條件下產(chǎn)GABA的量為31.46 mg/g，而未發(fā)酵桑葉粉產(chǎn) GABA的量為2.77 mg/g，最佳條件下GABA的產(chǎn)量比未發(fā)酵前提高了近11 倍。發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量為1.93 mg/g，總糖含量為34.13 mg/g，發(fā)酵產(chǎn)品的pH為5.69 。

3 討論與結(jié)論

自從出現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA，最常用的菌種有乳酸菌和大腸桿菌，通常利用乳酸菌生產(chǎn)較安全，大腸桿菌通常與基因工程相結(jié)合進(jìn)行改造，生產(chǎn)GABA有一定的風(fēng)險(xiǎn)；其次為酵母菌、曲霉菌等[22]。據(jù)研究，以酵母菌為菌株，在對(duì)其發(fā)酵特性的研究基礎(chǔ)上，菌株的 GABA質(zhì)量濃度為指標(biāo)開(kāi)展研究，培養(yǎng)基配方優(yōu)化后，菌株的 GABA質(zhì)量濃度提高了近 4 倍，達(dá)到 3.63 g/L[23]。李科等發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌 UL-4顯示出良好的耐酸耐膽鹽特性；在腸道具備一定的粘附和定植能力；菌株有良好的抑菌特性，尤其是金黃色葡萄球菌，抑菌圈達(dá)到15.77 mm；UL-4還具備對(duì)膽固醇和甘油三酯的降解能力，降解率分別為 73.23%和 19.11%[24]?？捎脕?lái)開(kāi)發(fā)功能性的食品。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室分離到的SG-5植物乳桿菌株發(fā)酵桑葉粉，探討發(fā)酵條件對(duì)GABA產(chǎn)量的影響。

滿足菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基需具備碳源，氮源以及生長(zhǎng)因子，選擇了葡萄糖和蛋白胨作為碳源，氮源，以便SG-5菌株產(chǎn)生更多GABA。足夠量的K2HPO4無(wú)機(jī)鹽可保證菌體正常的生長(zhǎng)代謝，L-谷氨酸鈉是發(fā)酵過(guò)程中GABA生成的底物，也可為菌體生長(zhǎng)提供氮源。添加少量L-谷氨酸鈉，發(fā)酵液中GABA也隨之增長(zhǎng)。這幾種物質(zhì)的含量并不是越多越好，當(dāng)添加的量超過(guò)菌體所需，就會(huì)起反效果，抑制菌體生長(zhǎng)影響產(chǎn)量。固態(tài)發(fā)酵時(shí)，GABA含量隨著菌體的生長(zhǎng)進(jìn)行合成。菌體生長(zhǎng)對(duì)初始含水量需求較高，含水量低不適合菌體的生長(zhǎng)。當(dāng)菌體進(jìn)入生長(zhǎng)平衡期，發(fā)酵產(chǎn)物GABA會(huì)被菌體自身利用而導(dǎo)致含量降低。發(fā)酵溫度及接種量控制不好則影響菌體的生長(zhǎng)，從而影響GABA的產(chǎn)量。

最佳發(fā)酵配方為：以桑葉粉為基質(zhì)，葡萄糖添加量2 %、蛋白胨添加量8 %、K2HPO42.0 % 和L-谷氨酸鈉1.5 %。最優(yōu)培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為36 h，接種量5 %，初始含水量60 % 時(shí)。在最佳配方和最佳發(fā)酵條件下桑葉 GABA的產(chǎn)量為31.46 mg/g，而未發(fā)酵桑葉粉 GABA含量為2.77 mg/g，最佳條件下GABA的產(chǎn)量比未發(fā)酵前提高了近11倍。發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量為1.93 mg/g，總糖含量為34.13 mg/g，發(fā)酵產(chǎn)品的pH為5.69。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2019.05.01

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017A020208044）；國(guó)家農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201403064）。

陳佩珊（1994－），女，廣西玉林人，2015級(jí)蠶學(xué)本科生。

陳芳艷，博士，副教授，碩士導(dǎo)師。

S888.2

B

2095-1205(2019)05-01-05