重癥監(jiān)護(hù)室患者耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌流行病學(xué)研究及同源性分析*

周朝瓊，鄧 勁，劉 翔，孔麗蕊

[1.成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院)檢驗(yàn)科，成都 611730；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，成都 610041]

肺炎克雷伯菌作為臨床常見和易于分離的條件致病菌，現(xiàn)階段該菌因其高耐藥率、高死亡率、高難度治愈率及高院內(nèi)感染率等特點(diǎn)被廣泛關(guān)注[1]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantklebsiellapneumoniae，CRKP)出現(xiàn)且呈遞增趨勢(shì)的原因是碳青霉烯類抗生素使用不當(dāng)所致[2]。有研究表明[3-5]醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)患者因其基礎(chǔ)疾病較多故CRKP感染率較高。本研究利用VITEK 2 Compact鑒定系統(tǒng)及細(xì)菌分型金標(biāo)準(zhǔn)[脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)[6]]對(duì)ICU感染CRKP患者進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，為醫(yī)院獲得性感染、臨床用藥及減少患者病死率等提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院2018年1月～2019年1月ICU患者24例，男性16例，女性8例，年齡16～85歲，24例菌株標(biāo)本類型有：痰(來(lái)自下呼吸道)、腦脊液、血液、尿液、尖端導(dǎo)管、腹腔積液及體表淺切口分泌物。

1.2 儀器與試劑 細(xì)菌鑒定采用布魯克公司的基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)，細(xì)菌藥敏采用梅里埃的全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定藥敏分析儀(VITEK 2 Compact)，補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)紙片購(gòu)自賽默飛公司，培養(yǎng)和藥敏所需的平板購(gòu)于安圖生物有限公司，二氧化碳孵箱采用上海博迅HH.CP-7W，血培養(yǎng)儀為梅里埃公司的全自動(dòng)血液培養(yǎng)儀Bact Alt 3D，PFGE儀器及配套設(shè)備、紫外線透照儀及一次成像照相系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與接種方法：深部痰標(biāo)本通過(guò)吸痰器采集，尿液采集清潔中段尿，血液采集來(lái)自不同穿刺點(diǎn)的外周血或?qū)Ч苎?，腦脊液經(jīng)腦室引流或腰椎穿刺，腹腔積液來(lái)自腹腔穿刺液，導(dǎo)管為撤除置管的尖端5 cm，分泌物標(biāo)本為沖洗后深部采集物。痰液、腦脊液、腹腔積液和分泌物為四區(qū)劃線，尿液標(biāo)本為“豐”字型劃線，導(dǎo)管尖端為半定量滾動(dòng)培養(yǎng)，血液為全自動(dòng)儀器培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)方法：細(xì)菌藥敏試驗(yàn)采用VITEK 2 Compact進(jìn)行。針對(duì)肺炎克雷伯菌敏感性試驗(yàn)選用的藥物為替加環(huán)素、多黏菌素B、阿米卡星、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢呋辛、頭孢西丁、慶大霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑、環(huán)丙沙星、哌拉西林和氨芐西林/舒巴坦。藥敏試驗(yàn)判斷參照2018年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)(https：//clsi.org)。

1.3.3 PFGE方法：PFGE操作步驟依次為細(xì)菌準(zhǔn)備，膠塊制備，細(xì)胞裂解，清洗膠塊，膠塊內(nèi)DNA的酶切，加樣，電泳，圖像獲取，數(shù)據(jù)分析，詳細(xì)步驟參照李秀清等[1]文中PFGE操作方法進(jìn)行。

1.3.4 菌株同源性判斷標(biāo)準(zhǔn)的方法：PFGE結(jié)果按TENOVER等[7]的標(biāo)準(zhǔn)判讀，如下：①同一克隆型：具有相同條帶數(shù)目和位置，則為同一菌株。②高度相關(guān)：僅有2～3個(gè)條帶變化，被認(rèn)為有親緣關(guān)系。③可能相關(guān)：通常為4～6個(gè)條帶變化。④無(wú)關(guān)：7個(gè)及以上條帶變化。

1.3.5 院內(nèi)感染判斷標(biāo)準(zhǔn)的方法：病人入院前無(wú)明確潛伏期的感染，入院后48 h在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染，包括住院期間獲得和在院內(nèi)獲得出院后發(fā)生的感染。

2結(jié)果

2.1 流行病學(xué)結(jié)果 24例CRKP菌株中58.33%來(lái)自痰(14株)，12.5%來(lái)自腦脊液(3株)，血液及尿液各2株，各占8.3%，分泌物、腹腔積液和尖端導(dǎo)管各1例，各占4.2%。24株感染CRKP的患者死亡率為54.2%，出院率為29.2%，轉(zhuǎn)歸率為16.7%(死亡：13/24，出院：7/24，轉(zhuǎn)歸：4/24)，該菌院內(nèi)感染率極高，占95.8%(23/24)，外院帶入感染者1例，占4.2%(1/24)。

2.2 細(xì)菌藥敏結(jié)果 采用全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定藥敏分析儀對(duì)24株細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，僅小于30%的感染者對(duì)多黏菌素B敏感，對(duì)其余抗生素均100%耐藥。

2.3 PFGE結(jié)果 按菌株同源性判斷標(biāo)準(zhǔn)，24株CRKP的PFGE圖譜結(jié)果為：1，3，5，6，7，8，11，12，13和14號(hào)標(biāo)本為同一克隆型，2號(hào)與10號(hào)為同一克隆型，16，17，18和20號(hào)為同一克隆型，19，21和23號(hào)為同一克隆型。4號(hào)、9號(hào)與1～3號(hào)、5～8號(hào)及11～14號(hào)菌株間有親緣關(guān)系，15，22和24號(hào)三者間也存在親緣關(guān)系，其他菌株基因組間同源性很差或無(wú)親緣關(guān)系，應(yīng)來(lái)自于不同克隆菌株，24株CRKP的PFGE圖譜見圖1。

3討論

3.1 治療多重耐藥肺炎克雷伯菌的首選藥物為碳青霉烯類抗生素，CRKP感染率因臨床對(duì)該藥應(yīng)用增加不斷上升[2，8]，該菌被美國(guó)疾病預(yù)防控制中心列為目前“最棘手細(xì)菌”[9]，有研究報(bào)道泛耐藥肺炎克雷伯菌(pan-drug resistantKlebsiellapneumoniae，PDRKPN)死亡率高達(dá)40%[10]，KARAISKOSL等[11]研究發(fā)現(xiàn)CRKP感染引起的死亡率可達(dá)23%～75%，感染CRKP的ICU患者院內(nèi)死亡率增高[12]，本研究24例ICU患者經(jīng)積極治療后仍有13例死亡，死亡率高達(dá)54.2%，可見該類患者治療困難，預(yù)后較差，死亡率極高[13-14]，有效抗生素的缺乏、較多的基礎(chǔ)疾病及免疫力降低均可增加患者死亡率。

3.2 CRKP作為院內(nèi)感染常見致病菌，2015年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(China highspeed information network，CHINET)結(jié)果顯示，其感染率已高達(dá)14%[15-16]，有國(guó)外報(bào)道稱其在醫(yī)院獲得性感染中位居第四[17]。醫(yī)院感染傳播途徑以空氣、接觸及媒介為主[18]，LI等[19]對(duì)NICU空氣環(huán)境及其患者病房環(huán)境進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，病房環(huán)境可成為CRKP的重要傳播途徑，同時(shí)也可成為潛在的感染源。PFGE因其高分辨率及高重復(fù)性，目前被公認(rèn)為是從基因水平上確定菌株間親緣關(guān)系的細(xì)菌分型金標(biāo)準(zhǔn)[6]。本研究PFGE基因分型結(jié)果顯示，24株CRKP菌株同源性較高，大多數(shù)菌株均屬同一克隆型，且不為同一克隆型部分菌株間存在親緣關(guān)系，僅少量菌株同源性較差或無(wú)親緣關(guān)系，從基因?qū)W角度提示院內(nèi)感染較嚴(yán)重，與實(shí)驗(yàn)中對(duì)患者是否為院內(nèi)感染的調(diào)查數(shù)據(jù)相吻合，該結(jié)果提示我院需采取有效的院感防控措施，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員、患者對(duì)院內(nèi)感染的防護(hù)及認(rèn)知，對(duì)病房環(huán)境及物品嚴(yán)格進(jìn)行相應(yīng)消毒及滅菌處理，常開窗保持空氣流通，對(duì)CRKP感染患者采取一定治療防護(hù)措施，避免引起其他患者或醫(yī)護(hù)人員的感染。

注：M為質(zhì)控菌株，1～24為1～24號(hào)菌株。

3.3 本研究藥敏結(jié)果顯示，臨床分離的24株CRKP除30%對(duì)多黏菌素B敏感外，對(duì)其余抗生素均耐藥，符合泛耐藥菌株定義[20]，較張麗等[21]研究中耐藥率更高，該結(jié)果提示我院應(yīng)進(jìn)一步規(guī)范控制抗生素的使用。CRKP泛耐藥導(dǎo)致臨床很難找到合適的抗感染治療方案，患者最終治療效果與臨床所選治療方案密切相關(guān)。臨床治療該類細(xì)菌感染可根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗生素，以指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素，對(duì)其進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)；同時(shí)遵循抗感染治療的基本原則(經(jīng)濟(jì)、安全、有效)，合理選藥、合理給藥，預(yù)防和避免抗生素間的不良反應(yīng)和相互作用，預(yù)防和延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，合理用藥及治療可極大提高患者生存率。

3.4 肺炎克雷伯菌主要存在于人體呼吸道及腸道內(nèi)，當(dāng)免疫力降低時(shí)，可引發(fā)肺部相關(guān)疾病，如大葉或小葉融合性實(shí)變則可因該菌經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺部而誘發(fā)[22]，本研究中CRKP主要分離自痰[23]，表明其主要定植在呼吸道，故應(yīng)加強(qiáng)感染CRKP可疑患者呼吸道的細(xì)菌檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)CRKP對(duì)患者臨床治療及用藥指導(dǎo)尤為重要。

3.5 綜上所述，我院CRKP菌株同源性較強(qiáng)，耐藥率極高，院內(nèi)感染極為嚴(yán)重，且感染CRKP患者死亡率極高，故應(yīng)加強(qiáng)并采取有效的院感防護(hù)措施，進(jìn)一步規(guī)范抗生素的使用，制定我院CRKP感染的治療方案和抗生素臨床應(yīng)用策略，減少患者感染率，提高感染患者生存率。