PTEN基因?qū)毙粤馨图?xì)胞白血病細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響

李曉麗,趙艷輝

(1 本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪 117000；2 武警遼寧總隊醫(yī)院 )

急性淋巴細(xì)胞白血病 (ALL)是臨床常見血液惡性腫瘤，發(fā)病率為1.7/10萬[1]，兒童2～5歲、成人50歲以后為高發(fā)年齡階段。ALL的治療有傳統(tǒng)化學(xué)療法及新型療法如單克隆抗體、免疫療法和其他靶向治療等。目前以上治療方法對于兒童患者效果較好，5年和10年總生存率分別為(80.0±1.2)%和(76.3±1.6)%，而對于成年患者，治愈率僅為20%～40%[2]。ALL是克隆性疾病，腫瘤細(xì)胞在增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制下大量累積在體內(nèi)[3]；同時，ALL細(xì)胞具有高侵襲性，ALL的惡性行為與細(xì)胞增殖、侵襲等密不可分[4]。研究顯示，10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因蛋白(PTEN)是抑癌因子，對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移有重要影響，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)[5]，其中ALL患者也有PTEN表達(dá)下調(diào)的研究報告[6]。2015年6月～2017年6月，我們首先檢測PTEN mRNA在ALL患者外周血中的表達(dá)水平，并采用過表達(dá)和沉默PTEN兩種技術(shù)，從正反兩方面研究PTEN對ALL細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響及作用機(jī)制，旨在獲得PTEN是治療ALL潛在分子靶點的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本溪市中心醫(yī)院確診為ALL患者50例及體檢健康人20例外周血各2 mL。逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒，購自日本TaKaRa公司；ALL細(xì)胞系CEM-C1、CCRF-CEM、Jurkat和人T淋巴細(xì)胞系 H9，購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清，購自美國Gibco公司；PTEN過表達(dá)和沉默病毒，由上海吉瑪生物有限公司包裝合成；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒，購自美國Thermo公司；MTS，購自上海碧云天公司；Boyden基質(zhì)膠，購自美國BD公司；Transwell小室、6孔板、培養(yǎng)瓶等耗材，購自美國corning公司；兔抗人p-p38MAPK抗體、鼠抗人GAPDH抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 PTEN mRNA表達(dá)檢測 設(shè)計PTEN引物F:5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′, R:5′-GGTGGGTTATG GTCTTCAAAAGG-3′；內(nèi)參GAPDH引物F: 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′, R:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。RNA提取試劑盒提取外周血或細(xì)胞中總RNA，以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR，獲得各樣品的循環(huán)閾值(Ct)；采用2-ΔΔCt法分析實驗數(shù)據(jù)，檢測PTEN mRNA的表達(dá)。所有被檢者均簽署知情同意書，標(biāo)本收集操作均符合醫(yī)院倫理委員會規(guī)定。

1.3 PTEN蛋白表達(dá)檢測 采用Western-blotting法。收集ALL細(xì)胞系各類細(xì)胞，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液。采用超聲冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min離心30 min，上清液為提取的細(xì)胞蛋白，BCA檢測蛋白濃度。加入loading buffer煮沸變性后電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，8%脫脂牛奶室溫封閉3 h，加入目的基因一抗孵育4 ℃過夜或常溫3 h，TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯示條帶。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒感染 ALL細(xì)胞系CEM-C1用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)、CCRF-CEM和Jurkat用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)，人T淋巴細(xì)胞系 H9用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。將呈對數(shù)生長期的CCRF-CEM細(xì)胞鋪至6孔板中，分為對照組、過表達(dá)組、沉默組，將對照、過表達(dá)PTEN病毒、沉默PTEN病毒以復(fù)感染指數(shù)20分別感染各組細(xì)胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測 收集各組細(xì)胞，以每孔2.5×103個細(xì)胞、100 μL培養(yǎng)基接種于96孔板中，每組每天6個復(fù)孔，共4 d，放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在對應(yīng)時間每孔加入20 μL MTS工作液，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，酶標(biāo)儀在波長490 nm處測取每孔的吸光度OD值。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測 收集各組細(xì)胞，以每孔2.5×103個細(xì)胞、100 μL培養(yǎng)基接種于Transwell小室上室的基質(zhì)膠上，下室加500 μL的含10% FBS的培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)趨化因子，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡觀察掉入下室細(xì)胞超過10個左右時終止培養(yǎng)，PBS洗3次后甲醇固定10 min，蘇木素染色，取出小室的聚碳酸酯微孔膜，顯微鏡下隨機(jī)計數(shù)3個視野穿過的細(xì)胞數(shù)目。

1.7 細(xì)胞遷移能力檢測 收集各組細(xì)胞，以每孔5×105個細(xì)胞、2 mL培養(yǎng)基接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，10 μL的槍頭沿直尺方向劃兩條直線劃痕，PBS將劃掉的細(xì)胞洗凈后，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。顯微鏡下拍照觀察24 h細(xì)胞遷移的情況。

2 結(jié)果

2.1 ALL患者外周血及ALL細(xì)胞系PTEN mRNA表達(dá) 外周血PTEN mRNA表達(dá)ALL患者(1.37±0.54)低于健康人(1.04±0.47)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022)。見圖1A。PTEN mRNA在ALL細(xì)胞系CEM-C1、CCRF-CEM和Jurkat中的表達(dá)水平低于人T淋巴細(xì)胞系H9中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1B。

圖1 ALL患者外周血及ALL細(xì)胞系PTEN mRNA表達(dá)

2.2 ALL細(xì)胞系PTEN 蛋白表達(dá) PTEN蛋白在ALL細(xì)胞系CEM-C1、CCRF-CEM和Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)低于人T淋巴細(xì)胞系H9中的表達(dá)(圖2A)。與對照組相比，PTEN蛋白在PTEN過表達(dá)組增加，在PTEN沉默組減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖2B)。

圖2 ALL細(xì)胞系PTEN 蛋白表達(dá)

2.3 PTEN對CCRF-CEM細(xì)胞增殖能力的影響 與對照組相比，PTEN過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力降低，PTEN沉默組細(xì)胞增殖能力增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖3)。

圖3 PTEN對CCRF-CEM細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 PTEN對CCRF-CEM細(xì)胞侵襲能力的影響 與對照組相比，PTEN過表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力減弱，PTEN沉默組細(xì)胞侵襲能力增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖4)。

圖4 PTEN對CCRF-CEM細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 PTEN對CCRF-CEM細(xì)胞遷移能力的影響 對照組、PTEN過表達(dá)組和PTEN沉默組劃痕愈合比分別為(15.79±0.61)%、(6.11±0.30)%和(26.11±0.30)%。與對照組相比，PTEN過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力減弱，PTEN沉默組細(xì)胞遷移能力增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.6 PTEN 對p38MAPK信號通路的影響 與對照組相比，PTEN過表達(dá)組和PTEN沉默組細(xì)胞中p38MAPK蛋白的表達(dá)均無差異(P均>0.05)；與對照組相比，PTEN過表達(dá)組細(xì)胞中p-p38MAPK蛋白表達(dá)增加，PTEN沉默組細(xì)胞中p-p38MAPK蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖5)。

圖5 PTEN對p38MAPK信號通路的影響

3 討論

ALL是T細(xì)胞和B細(xì)胞譜系的祖細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大量未成熟的早期白細(xì)胞，并聚集在骨髓中抑制正常造血功能，同時可以侵入外周血進(jìn)入全身循環(huán)[2]?；煹膽?yīng)用可以提高ALL患者的緩解率和延長生存時間，但對于復(fù)發(fā)和難治性ALL患者效果不佳，其中復(fù)發(fā)性ALL是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[7]；此外，化學(xué)藥物的重大毒性仍然是患者生活質(zhì)量降低的主要因素[8]，因此尋找ALL新的治療方法十分重要。目前，分子靶向藥物治療肺癌、肝癌等實體瘤已取得了較好效果[9]。但是ALL的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其分子靶向藥物療法廣受限制。研究報道，表觀遺傳和遺傳畸變是ALL的致病因素，癌基因和抑癌基因的改變在ALL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。

PTEN定位于染色體10q23.3，全長5.572 kb，是最重要的抑癌基因之一。有學(xué)者[11]首次報告PTEN在多種人類腫瘤中具有高頻率的突變，包括原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系、前列腺癌細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系。PTEN基因突變、丟失及體細(xì)胞失活等是引起腫瘤等相關(guān)疾病的潛在原因。Paganin等[12]報告257例患有T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的兒童中31例存在PTEN突變，并且PTEN突變與復(fù)發(fā)風(fēng)險增加顯著相關(guān)。同時PTEN可以編碼多種特殊的蛋白質(zhì)，在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長、增殖及抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。有報道PTEN調(diào)節(jié)FAK和Akt磷酸化水平誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡[13]。PTEN可以作為多種miRNAs的直接靶基因、癌基因和抑癌基因的下游基因參與腫瘤的惡性進(jìn)展，miR-106b通過直接靶向PTEN促進(jìn)了食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞EC-1和EC9706的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。DUXAP10 在慢性粒細(xì)胞白血病組織和細(xì)胞中高表達(dá)，可通過抑制PTEN的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡[15]PTEN mRNA和蛋白在ALL新診斷及復(fù)發(fā)患者外周血中的表達(dá)水平均顯著低于正常和緩解患者中的表達(dá)水平[6]。

本研究顯示，PTEN mRNA在ALL患者外周血的表達(dá)水平顯著低于對照健康人，在ALL細(xì)胞系CEM-C1、CCRF-CEM和Jurkat中的表達(dá)水平均顯著低于人T淋巴細(xì)胞系H9。此結(jié)果與Ren等[6]報告一致。ALL患者血液和細(xì)胞系中PTEN表達(dá)降低提示其可能為抑癌基因。我們進(jìn)一步采用過表達(dá)和沉默慢病毒感染CCRF-CEM細(xì)胞使其過表達(dá)和沉默PTEN表達(dá)后，檢測PTEN在ALL細(xì)胞中的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PTEN組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力均下降，沉默PTEN組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力均增強，表明PTEN具有抑制ALL細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的生物功能。

PTEN是具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶雙重活性的抑癌基因。PTEN的N端185個氨基酸具有脂質(zhì)磷酸酶活性，可以將磷脂酰肌醇3, 4, 5三磷酸(PIP3)的D3位去磷酸為PIP2，使PIP3的作用減弱，從而抑制PI3K/Akt信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G1期，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。PTEN的C端218個氨基酸具有磷酸化位點，可以脫去磷酸絲/蘇氨酸、磷酸酪氨酸的磷酸基團(tuán)，負(fù)調(diào)控MAPK信號通路，抑制腫瘤的惡性生物學(xué)行為。PTEN在腫瘤中抑制PI3K/Akt信號發(fā)揮作用的研究較多[16]，MAPK在ALL中異常激活。p38MAPK是MAPKs家族中的重要亞型，與肝癌、肺癌等常見腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。p38MAPK發(fā)生磷酸化成為p-p38MAPK可發(fā)揮重要生物學(xué)作用，p-p38MAPK表達(dá)升高能抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病的細(xì)胞增殖[17]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)PTEN組和沉默PTEN組細(xì)胞中p38MAPK的表達(dá)均無明顯差異，過表達(dá)PTEN組細(xì)胞中p-p38MAPK蛋白表達(dá)增高，沉默PTEN組細(xì)胞中p-p38MAPK蛋白表達(dá)降低，說明PTEN可能通過激活p38MAPK信號通路發(fā)揮抑制ALL增殖、侵襲和遷移的作用。