X射線交錯互補修復基因3在膠質瘤中的表達及臨床意義

張墨軒，馮帆，潘景臻，崔洪瑋，張健，劉偉

(1 濰坊醫(yī)學院，濰坊261053；2 臨沂市人民醫(yī)院)

膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、最具侵襲性的腫瘤，約占顱內腫瘤的40%[1]。根據(jù)WHO分類，膠質瘤病理分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級[2]。近年來，雖然膠質瘤的總體治療效果有了顯著提高，但是高等級膠質瘤患者的平均預期壽命仍僅有14個月[3]。因此，進一步探討膠質瘤的發(fā)生機制及其治療新靶點是提高膠質瘤患者生存率的迫切需要。X射線交錯互補修復基因3(XRCC3)參與同源重組修復途徑(HRR)，是癌癥易感性高度可疑候選基因[4]。最新文獻報道，XRCC3在膀胱癌、乳腺癌和結腸直腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5,6]。然而，XRCC3在膠質瘤中的表達差異及其與預后的關系尚不清楚。為此，本研究對膠質瘤中XRCC3的表達及其意義進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年7月～2014年7月臨沂市人民醫(yī)院住院治療的膠質瘤患者腫瘤標本65例，男35例、女30例，中位年齡44歲；患者均為首次手術治療，膠質瘤診斷均經(jīng)病理檢查證實。腫瘤大?。褐睆健? cm 51例，<4 cm 14例；腫瘤部位：位于額葉35例，顳葉19例，其他11例；膠質瘤KPS評分：<80分34例，≥80分31例；WHO病理分級：Ⅰ～Ⅱ級31例，Ⅲ～Ⅳ級34例。另選取同期在臨沂市人民醫(yī)院因創(chuàng)傷性腦損傷行顱內減壓術獲得的正常腦組織標本10例及瘤旁證實為正常腦組織標本30例進行對照研究。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 膠質瘤及正常腦組織XRCC3表達檢測 將65例膠質瘤組織及40例正常腦組織在中性緩沖甲醛溶液中固定24 h，后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋處理。將石蠟包埋的膠質瘤標本及正常腦組織標本切成3 μ m厚的切片，隨后石蠟切片在70 ℃下烘烤1 h，二甲苯脫蠟并用順濃度梯度乙醇水化。脫蠟水化后的切片在10 mmol/L檸檬酸緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司)中微波加熱進行抗原修復，修復后自然冷卻至室溫。滴加阻斷內源性過氧化物酶(北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫孵育10 min并用PBS緩沖液沖洗3次，1次2 min。用正常山羊血清(北京中杉金橋生物技術有限公司)封閉10 min，傾去封閉液后滴加單克隆抗XRCC3抗體(武漢三鷹生物技術有限公司, 1∶100)在4 ℃過夜，PBS緩沖液沖洗3次，1次2 min。滴加抗鼠/兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)在室溫下孵育30 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素(北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次，1次2 min。加入適量新鮮配制的DAB(北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫暗箱孵育3～5 min，加水終止顯色，流動水沖洗，蘇木素、鹽酸乙醇分化液和氨水返藍復染，最后行脫水、透明、封片處理。每個樣本通過免疫組化著色強度和陽性細胞百分比進行評估。陽性腫瘤細胞的百分比評分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分。染色強度分為四個等級(強度評分)：陰性(0分)、淺棕色(1分)、棕色(2分)、棕褐色(3分)。將強度評分和百分比評分相乘產(chǎn)生得分，得分≤4分定義為XRCC3低表達，得分>4分定義為XRCC3高表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗分析XRCC3表達與臨床病理特征的相關性，采用Kaplan-Meier分析膠質瘤XRCC3表達與生存時間的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 XRCC3在膠質瘤組織中表達上調 免疫組化染色顯示，XRCC3在膠質瘤組織和正常腦組織表達主要位于細胞質中，細胞核表達較弱。見圖1。正常腦組織XRCC3高表達率為20.0%(8/40)，膠質瘤組織XRCC3高表達率為50.8%(33/65)，二者XRCC3高表達率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。

注：A 正常腦組織；B Ⅱ級膠質瘤組織；C Ⅳ級膠質瘤組織；D 陰性對照(未加一抗)。

圖1XRCC3在不同等級膠質瘤中表達情況(免疫組化染色，×200)

2.2 XRCC3表達與膠質瘤患者臨床特點的關系 單因素分析顯示XRCC3的表達與性別、年齡、腫瘤直徑、發(fā)病部位、KPS評分等因素無關(P均>0.05)。Ⅲ～Ⅳ 級膠質瘤XRCC3高表達率高于Ⅰ～Ⅱ 級膠質瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。見表1。

2.3 XRCC3的表達與膠質瘤患者預后之間的關系 65例患者均進行了跟蹤隨訪，根據(jù)XRCC3表達差異與患者生存時間繪制Kaplan-Meier生存曲線(圖2)。顯示XRCC3低表達生存時間6～108(68±3.08)個月，XRCC3高表達生存時間1～97(24±7.10)個月，兩者生存時間比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。

表1 膠質瘤組織XRCC3表達與臨床特點的關系[例(%)]

圖2 不同XRCC3表達水平膠質瘤患者生存曲線

3 討論

近年來，盡管有研究者不斷發(fā)現(xiàn)與膠質瘤形成、入侵、進展以及患者預后有關的分子標志物如IDH突變、MGMT啟動子甲基化、染色體lp / 19q雜合性缺失和TERT啟動子突變等[8]，但是對膠質瘤發(fā)生的確切機制仍了解不多，臨床缺少膠質瘤有效治療方法是大家的普遍共識。目前，在哺乳動物細胞中人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種成熟的DNA修復途徑，分別是核苷酸切除修復、堿基切除修復、錯配修復和雙鏈斷裂修復[9]。DNA雙鏈斷裂是最常見和最危險的DNA損傷類型，可導致細胞基因組不穩(wěn)定，進而導致腫瘤發(fā)生和進展[10,11]。DNA雙鏈斷裂具有2種主要的修復方式，即同源重組修復和非同源末端連接[7]。同源重組修復是指發(fā)生在非姐妹染色單體之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。DNA雙鏈斷裂后基因組完整性的修復是細胞抵御環(huán)境損傷的主要手段。DNA雙鏈斷裂一旦被錯誤修復，可導致細胞染色體異常，引發(fā)細胞向惡性轉化，最終導致腫瘤的發(fā)生[12]。

作為細胞應對環(huán)境破壞的主要防御手段，DNA修復對維持基因組的完整性至關重要。從理論上講，DNA修復蛋白表達的減少或丟失會破壞DNA修復能力，導致基因組不穩(wěn)定，從而增加對腫瘤的易感性。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，DNA修復蛋白的表達變化相當復雜，有些表達下調，有些表達上調。XRCC3是參與同源修復通路中的核心蛋白之一，其基因位于人類染色體14q32.3，編碼DNA修復蛋白[11]。XRCC3蛋白是人類RAD51的同源蛋白，在同源重組修復通路中通過與其他蛋白相互作用有效修復DNA損傷[13]。目前，已在多種腫瘤組織中檢測到XRCC3異常表達。如在結直腸癌中XRCC3多態(tài)性與結直腸癌的易感性相關[14]，在乳腺癌中XRCC3與RAD51的表達呈正相關并在腫瘤中呈高表達狀態(tài)[10]。本研究顯示XRCC3在膠質瘤組織中高表達率為50.8%，遠遠高于正常腦組織，提示XRCC3可能參與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展進程。

文獻報告，XRCC3對替莫唑胺導致的膠質母細胞瘤細胞DNA雙鍵斷裂有修復作用，參與膠質母細胞瘤的化療耐藥形成過程[2]。但是，膠質瘤XRCC3表達與患者臨床特點及腫瘤分級的關系未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，XRCC3表達與膠質瘤患者性別、年齡、腫瘤大小、發(fā)病部位及KPS評分無明顯相關性；Ⅲ～Ⅳ 級膠質瘤XRCC3高表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ 級膠質瘤，XRCC3在膠質瘤中的表達與病理分級相關。有研究顯示，食管鱗癌患者XRCC3表達與放化療耐藥有關，XRCC3高表達患者生存期較短[15]；肝細胞癌患者XRCC3多態(tài)性與預后相關，XRCC3 Thr/Met和Met/Met基因型患者中位生存時間較短[16]。本研究顯示，膠質瘤XRCC3高表達者生存時間縮短，XRCC3高表達與膠質瘤預后不良相關。

綜上所述，XRCC3在膠質瘤中呈高表達，病理分級越高表達越高，且高表達患者預后較差，提示XRCC3可能是膠質瘤的1個新型診斷標志物、預后預測因子及藥物治療靶點。