動(dòng)物狂犬病的研究進(jìn)展

洪都孜·波拉提 吳建勇 古努爾·吐爾遜 穆妮熱·喀迪爾 鐘 旗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊 830013)

狂犬病（Rabies）是狂犬病毒所致的急性傳染病，多見于犬、狼、貓等肉食動(dòng)物，人多因被病獸咬傷而感染。臨床表現(xiàn)為特有的恐水、怕風(fēng)、咽肌痙攣、進(jìn)行性癱瘓等。因恐水癥狀比較突出，故本病又名恐水癥（Hydrophobia）。動(dòng)物通過互相間的撕咬而傳播病毒。我國的狂犬病主要由犬傳播，家犬可以成為無癥狀攜帶者，所以表面“健康”的犬對人的健康危害很大。對于狂犬病尚缺乏有效的治療手段，人患狂犬病后的病死率接近100%，患者一般于3～6 d內(nèi)死于呼吸或循環(huán)衰竭，故應(yīng)加強(qiáng)預(yù)防措施。

1 病原學(xué)

1.1 狂犬病病毒結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)特點(diǎn)

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus，LV），外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內(nèi)含有單鏈RNA。是引起狂犬病的病原體?？袢《揪哂袃煞N主要抗原：一種是病毒外膜上的糖蛋白抗原，能與乙酰膽堿受體結(jié)合使病毒具有神經(jīng)毒性，并使體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體及血凝抑制抗體，中和抗體具有保護(hù)作用；另一種為內(nèi)層的核蛋白抗原，可使體內(nèi)產(chǎn)生補(bǔ)體結(jié)合抗體和沉淀素，無保護(hù)作用。

已發(fā)現(xiàn)的LV除4種未分型外，其他分屬7個(gè)基因型，在歐洲大陸已發(fā)現(xiàn)了IRKV、WCBV和基因Ⅴ、Ⅵ型LV分布。該屬包括了12個(gè)已定種和2個(gè)暫定種，除RABV外其他種的病毒統(tǒng)稱為（rabiesrelated virus，RRV）。RABV基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA，全長約為12 kb。RABV五個(gè)結(jié)構(gòu)基因編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核蛋白（nucleoprotein，N），磷蛋白（phosphoprotein，P），基質(zhì)蛋白（matrix protein，M），糖蛋白（glycoprotein，G）和病毒依賴的RNA聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，L）。L蛋白為最大結(jié)構(gòu)蛋白，是一種多功能酶，主要負(fù)責(zé)病毒基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工。M蛋白為最小結(jié)構(gòu)蛋白，是一種連接蛋白，在核衣殼和囊膜之間起著相互作用，并將兩者連接在一起，可直接影響G蛋白構(gòu)型。目前研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白似乎與宿主對狂犬病的免疫反應(yīng)有關(guān)。

1.2 病毒的理化特性

Carnieli等[7]報(bào)道，狂犬病病毒不穩(wěn)定，但能抵抗自溶及腐爛，在自溶的腦組織中可以保持活力7～10 d。對神經(jīng)組織較強(qiáng)的嗜性是狂犬病病毒的主要特征，與其他組織細(xì)胞相比，狂犬病病毒在神經(jīng)組織細(xì)胞中繁殖和復(fù)制的效率極高?？袢〔《緦ψ贤饩€，日光，熱，干燥敏感，對其抵抗力較弱，一般加熱50℃ 1 h或加熱60℃ 5 min即可殺死病毒，該病毒對強(qiáng)酸，強(qiáng)堿敏感，容易被滅火。同時(shí)狂犬病病毒對甲醛，乙酸，碘，肥皂水，20%乙醚，10%氯仿以及離子型和非離子型去污劑均敏感，可滅火病毒[8]。病毒在凍干條件下可以長期存活，在50%甘油中保存的腦組織病毒至少可以存活一個(gè)月，4℃保存數(shù)周，低溫中保存數(shù)月至數(shù)年，室溫中保存不穩(wěn)定。反復(fù)凍融可使病毒滅活，紫外線照射、蛋白酶、酸和季銨類化合物（如新潔爾滅）、自然光及熱等都可迅速破壞病毒活力。真空條件下凍干保存的病毒于4℃存活可達(dá)數(shù)年。

2 流行現(xiàn)狀

作為一種古老的人獸共患病，狂犬病在世界范圍內(nèi)廣泛存在。2013年，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）調(diào)查顯示目前有150個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道過狂犬病的流行，僅有部分發(fā)達(dá)國家和地區(qū)的島嶼沒有狂犬病報(bào)告，每年55000多人死于狂犬病。我國作為狂犬病高發(fā)國家，每年有上千人死于狂犬病，狂犬病發(fā)病和死亡人數(shù)居于世界第2位，僅次于印度。在 20 世紀(jì)，人類在與狂犬病的斗爭中取得了重大勝利，90 年代北美地區(qū)死于狂犬病的人數(shù)降至個(gè)位數(shù)[12]，歐洲各國 除俄羅斯外，狂犬病發(fā)病率也控制到每年 1～2個(gè)的水平，甚至有些國家多年都沒有出現(xiàn)過狂犬病疫情。中國在狂犬病 防治上也取得了巨大進(jìn)步，雖然疫情有所反復(fù)，但總體呈現(xiàn) 下降趨勢，2017 年共有 502 人死于狂犬病，遠(yuǎn)低于 2007 年的3300 人。如圖2所示?；诖耍?015 年 12 月，世界衛(wèi)生組織、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織、聯(lián)合國糧農(nóng)組織和全球狂犬病控制聯(lián)盟合作啟動(dòng)了到“2030 年實(shí)現(xiàn)人類狂犬病零死亡” 全球框架。

圖2 近十年中國死于狂犬病人數(shù)統(tǒng)計(jì)

目前感染犬是我國人和動(dòng)物狂犬病最主要的傳播來源，其中95%人狂犬病均是由患病犬咬傷、舔舐破損皮膚所致。病毒在體內(nèi)典型的感染過程是由唾液中帶有狂犬病毒的瘋動(dòng)物咬傷，使病毒從口侵入機(jī)體內(nèi)。在侵入部位一般不增生，也不侵入血液，故無病毒血癥。狂犬病毒從入侵局部進(jìn)入周圍神經(jīng)組織內(nèi)，沿著神經(jīng)向心性傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

我國狂犬病主要分布在人口密集的南方地區(qū)，其次為東部地區(qū)，東北和西部省份狂犬病疫情較少發(fā)生。我國流行毒株分為4個(gè)進(jìn)化群，即亞洲1群、亞洲2群、北極相關(guān)群和世界群。亞洲1群分布最廣，在我國中部和東南部的22個(gè)省份流行；亞洲2群在我國東南12個(gè)省市流行；北極相關(guān)群主要在內(nèi)蒙古傳播流行；世界群毒株在我國散在分布，其分支世界群草原型毒株主要在新疆和內(nèi)蒙流行。新疆，狂犬病的主要傳播來源是狐貍、狼等野生動(dòng)物，2012年起該省出現(xiàn)多起野生狐貍引發(fā)家畜狂犬病的報(bào)道，該群毒株屬于世界群草原型。

3 診斷檢測技術(shù)

3.1 病原學(xué)診斷

3.1.1 病毒分離

首先采集動(dòng)物或患者死后的新鮮腦組織或甲醛固定的腦組織，腦干要包含在采集的腦組織混合物中，將采集到的病毒標(biāo)本進(jìn)行冷凍保存。病毒分離方法有兩種，一種是采用乳鼠體內(nèi)接種法，即在乳鼠體內(nèi)接種腦組織懸液，采用免疫熒光技術(shù)對乳鼠腦組織進(jìn)行檢測，此方法時(shí)間較長，需25 d后方可獲得結(jié)果，且費(fèi)用較高。另一種是細(xì)胞培養(yǎng)法，即采用鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2 d，然后采用免疫熒光技術(shù)對狂犬病毒內(nèi)基氏小體進(jìn)行檢測。

3.1.2 熒光抗體檢測（FAT）

熒光抗體檢測熒光抗體檢測（FAT）是OIE推薦用于檢測狂犬病病原的技術(shù)之一。FAT可用于檢測壓印片、細(xì)胞培養(yǎng)物及小鼠腦組織中的病原。Muhamuda等[20]報(bào)道，F(xiàn)AT的檢測原理是發(fā)光抗體與抗原相結(jié)合后，在紫外線照射下，用顯微鏡檢查熒光素的有無來判斷被檢樣品中的病原。FAT技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是步驟簡便、耗時(shí)短、敏感性強(qiáng)，適用于檢測新鮮病料、甘油保存樣品及被甲醛固定的標(biāo)本，病原檢出率大于99%。

3.1.3 乳鼠接種試驗(yàn)

將采集的腦組織（病動(dòng)物的大腦皮層、海馬或小腦、延髓等組織）勻漿懸液與含抗菌素的等滲緩沖液配成20%（W/V）溶液，待過濾后進(jìn)行乳鼠腦內(nèi)接種，最后利用熒光抗體實(shí)驗(yàn)對死亡鼠進(jìn)行狂犬病毒檢測。動(dòng)物接種試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是可以收獲大量的病毒，用于毒株的保存及后續(xù)鑒定工作，缺點(diǎn)是這個(gè)試驗(yàn)必須使用SPF動(dòng)物，試驗(yàn)成本高，不適用于大規(guī)模檢測工作。

3.2 血清學(xué)診斷

3.2.1 熒光抗體病毒中和試驗(yàn)

熒光抗體病毒中和檢測試驗(yàn)（FAVN）是將抗體血清與狂犬病病毒在體外中和，然后接種BHK-21細(xì)胞或C13細(xì)胞，測定血清抗體100%中和病毒及血清滴度在50%以上就能中和病毒時(shí)的血清稀釋度。原始的FAVN方法已被改進(jìn)，目前常用的方法為96孔微量板定量法。

3.2.2 快速熒光灶抑制試驗(yàn)

RFFIT是WHO狂犬病專家委員會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，常用以評(píng)價(jià)RABV中和抗體的含量?？贵w水平是監(jiān)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)的重要工具。該實(shí)驗(yàn)是讓血清進(jìn)行三倍系列稀釋檢測，將狂犬病毒與預(yù)先滴定過的中和進(jìn)行等量混合，需在37℃溫度條件下中和1 h，然后將96孔E接種形成單位的BSR細(xì)胞，再在37℃下的CO2孵箱中培養(yǎng)1 d，并將其固定同時(shí)進(jìn)行熒光抗體染色，最后用熒光鏡觀察并將熒光灶數(shù)記錄好，然后根據(jù)該數(shù)量計(jì)算血清抗體效價(jià)。

3.3 分子生物學(xué)診斷

該診斷方法主要是通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)直接擴(kuò)增病毒株特異而保守的N基因。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)有兩大特點(diǎn)，一是靈敏度極高，二是特異性極高；其在大規(guī)模樣品的初步篩選中是無可替代的，且檢測結(jié)果直觀，容易判定。不過其結(jié)果也會(huì)受非特異性序列變異、病毒稀釋間接性、樣品采集時(shí)間、樣品類型等影響，所以其試驗(yàn)結(jié)果僅供參考，不可作為確診依據(jù)。

4 疫苗

狂犬病疫苗已經(jīng)有上百年的發(fā)展歷史，法國科學(xué)家巴斯德早在1885年就制備出了世界上第一支狂犬病疫苗，首次用于人體并成功預(yù)防了狂犬病?？袢∫呙绲难芯恳恢笔强袢》揽丶夹g(shù)研究中的一個(gè)最重要組成部分?？袢∫呙绲难芯恐饕?jīng)歷了3個(gè)階段，通過感染組織或感染雞胚等方法制備的組織疫苗，為第一代狂犬病疫苗；通過人工感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞制備的弱毒疫苗或滅火疫苗，成為第二代疫苗；通過分子生物學(xué)技術(shù)制備的疫苗為第三代疫苗。

4.1 神經(jīng)組織疫苗

最早的狂犬疫苗是利用動(dòng)物的神經(jīng)和腦組織制備的，因此稱為神經(jīng)組織疫苗。1885年路易·巴斯德成功地利用神經(jīng)組織疫苗挽救了一名被瘋狗嚴(yán)重咬傷的兒童。神經(jīng)組織疫苗免疫同時(shí)也具有強(qiáng)烈的毒、副作用，后來雖然有所改進(jìn)，但仍能致人癱瘓甚至死亡。WHO于1984年建議停止生產(chǎn)和使用這類疫苗。

4.2 禽胚組織疫苗

1956年以后又成功的利用鴨胚研制出禽胚組織疫苗，這種疫苗多數(shù)用于暴露前的免疫，產(chǎn)生中和抗體水平較腦組織疫苗低，偶有神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生[27]。1980年瑞士Berna廠用化學(xué)提取和區(qū)帶離心純化技術(shù)生產(chǎn)出一種鴨胚純化疫苗，接種后與二倍體疫苗產(chǎn)生的抗體水平相當(dāng)，不良反應(yīng)很輕，但產(chǎn)量較低，應(yīng)用量很少。

4.3 細(xì)胞培養(yǎng)疫苗

20世紀(jì)60年代以后細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的制備技術(shù)得到較大發(fā)展，主要有地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)疫苗、純化雞胚細(xì)胞疫苗、Vero細(xì)胞疫苗和人二倍體細(xì)胞疫苗，目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的狂犬疫苗為這類疫苗。

5 結(jié)語

狂犬病是一種呈世界分布的自然疫源性疾病，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷是控制狂犬病流行的有效方式。目前，全球仍有大約150個(gè)國家或地區(qū)中有狂犬病流行，有30余個(gè)國家和地區(qū)消除了由犬類傳播給人類的狂犬病。但在中國，狂犬病仍是困擾公眾的一個(gè)公共衛(wèi)生威脅。偶爾有媒體報(bào)道有個(gè)別患者注射了疫苗仍發(fā)作狂犬病，造成了一定范圍的恐慌，所以我們得重視對狂犬病疫苗的監(jiān)督，研制出更有效果的更好的疫苗，正確認(rèn)識(shí)狂犬病有助于控制狂犬病的傳播。