• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測豬傳染性胃腸炎的方法

      2019-08-19 06:19:46毛瑞鋒林思雨宋慶浪蔣珊珊孫宇喆原冬偉
      獸醫(yī)導(dǎo)刊 2019年18期
      關(guān)鍵詞:特異性引物病毒

      毛瑞鋒 林思雨 宋慶浪 蔣珊珊 孫宇喆 原冬偉

      (黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

      豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起的一種高度接觸性傳染病,可以感染任何年齡段的豬,對15日齡左右的仔豬危害最大,死亡率可達100%。1946年美國學(xué)者首次報道TGE,我國于1964年首次分離得到TGEV,到目前為止,我國大部分地區(qū)都存在該病毒。本病目前已呈世界性分布,目前是造成仔豬發(fā)病和死亡的主要疫病之一,給養(yǎng)殖業(yè)造成極大損失。目前對TGEV的檢測方法主要有病毒的分離鑒定、電子顯微鏡檢測、血清學(xué)檢測(病毒中和試驗、ELISA、膠體金)、間接免疫熒光、免疫組化、核酸探針雜交技術(shù)檢測、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、熒光定量PCR等。這些檢測方法都具有良好的特異性和靈敏性,可以對臨床樣品進行準確的實驗室檢測,但是都存在缺點和不足,特別是一些檢測方法對操做人員或儀器有較高要求,不利于推廣,所以很難用于基層臨床檢測。因此建立一種簡單、快速的檢測方法開始成為目前此方面的研究重點。

      環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)是在2000年日本學(xué)者 Notomi 等開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法,其特點是針對靶基因的 6 個區(qū)域設(shè)計 4 種特異引物,核酸鏈通過在等溫環(huán)境中的循環(huán)置換擴增實現(xiàn)對靶序列的放大。該方法能在恒溫條件下快速、準確、特異地擴增目的DNA的技術(shù),在反應(yīng)體系加入逆轉(zhuǎn)錄酶后,也可直接檢測RNA。由于這種檢測方法的具有具有簡單、快速、特異性強、靈敏度高、操作方便、結(jié)果判定簡單、成本低廉等特點,特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用,有著極為廣泛的應(yīng)用前景。目前該技術(shù)已被利用于多個領(lǐng)域?qū)Σ煌≡w進行檢測,如在錦鯉皰疹病毒,非洲豬瘟病毒,H7N9禽流感病毒、犬細小病毒等動物病毒性病原的檢測上得到了應(yīng)用。本研究針對 TGEV N 基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物,并優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了一種適合基層實驗室使用的快速、靈敏、特異、準確的 RT-LAMP 檢測方法并進行了初步臨床驗證。

      1 材料與方法

      1.1 病毒株、病料及主要試劑

      TGEV-Q2016 和 TGEV-HX 株由本實驗室分離并保存;TGEV-HX由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈;PEDV、PDCoV、PRoV 均為本實驗室保存;臨床 TGEV 病料由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬病研究室提供;DNA/RNA 提取試劑盒、隨機引物、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNA 酶抑制劑(RNase Inhibitor)、dNTPs 購自索萊寶生物有限公司;DNA 聚合酶(Bst DNA Polymerase)購自 NEB公司;甜菜堿(Betaine)購自 Sigma 公司。

      1.2 引物設(shè)計與合成

      參照 GenBank 中 36 株 TGEV 分離株 N 基因序列,DNAStar中 MegAlign 分析程序?qū)Ρ冗x取同源性95%以上的保守區(qū)段序列,再利用在線軟件 Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lamp5.0./index.html)作為輔助,在 TGEV N 基因保守區(qū)域篩選 4條最佳條件 RT-LAMP 引物,其中包括 2 條外引物 F3/B3 和 2 條內(nèi)引物 FIP/BIP(見表 1),擴增目的片段大約 200 bp,引物由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。將引物用無菌蒸餾水溶解至 100 μmol/L,- 20℃ 保存?zhèn)溆茫褂脮r進行適當(dāng)稀釋。

      表1 本試驗中使用的引物序列

      1.3 病毒 RNA 提取和 cDNA 合成

      用 TRIzol 試劑(Invitrogen 公司)提取病毒 RNA,具體操作方法參照說明書進行。提取的病毒 RNA 用 20 μL DEPC 水溶解,進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。往 20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系中加入 RNA 溶解液、5×Buffer、dNTPs、RNase Inhibitor、M-MLV 和 9-mer 隨機引物,在42 ℃下水浴1 h,最后70 ℃ 10 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶。所得產(chǎn)物作為 LAMP 反應(yīng)的模板 DNA。

      1.4 LAMP 檢測方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

      以 TGEV-Q2016 株全長 cDNA 為模板,LAMP 擴增體系初步按文獻[7]進行,根據(jù)反應(yīng)體系條件優(yōu)化策略,對內(nèi)外引物、Betaine 濃度、Bst DNA PoLymerase 濃度、dNTP 濃度、反應(yīng)溫度與時間等條件分別進行了優(yōu)化。由于外引物對實驗結(jié)果影響很小,所以實驗中固定外引物濃度,調(diào)整內(nèi)引物濃度,使外引物與內(nèi)引物濃度比例分別為 1:1~1:7;Betaine(5 M/L)的終濃度為 0.1M~0.8M;Bst DNA PoLymerase(8000 U/mL)終濃度為2U~16U;dNTPs(10 mmol/L)的終濃度為 5 μM ~25 μM;在完成以上所有條件優(yōu)化基礎(chǔ)將溫度從 58 ℃~65 ℃,以 1℃ 依次遞增確定最佳退火溫度;反應(yīng)時間從 20 min~80min,以 10 min依次遞增確定最佳反應(yīng)時間。反應(yīng)結(jié)束后,取 6 μL RT-LAMP 擴增產(chǎn)物,于 21% 瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

      1.5 LAMP 的敏感性試驗

      將 TGEV-Q2016 株反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 作為模板,分光光度計確定濃度后計算起始拷貝數(shù),無菌去離子水10 倍連續(xù)稀釋,運用優(yōu)化好的 LAMP 方法同時與實驗室常規(guī)檢測 TGEV 所用 PCR 進行檢測,進而對反應(yīng)的敏感性進行比較。

      1.6 LAMP 的特異性試驗

      用建立好的 LAMP 方法分別對 TGEV-Q2016 株、TGEVHX、PEDV、PDCoV、PRoV進行核酸擴增,待反應(yīng)結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。

      1.7 重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測

      取等量的 5 份不同代次的 TGEV-Q2016 株細胞傳代回收樣品,對每份樣品提取 RNA,反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA 進行 LAMP 檢測;同時對第 5 次傳代TGEV-Q2016 株樣品反復(fù) 5 次進行 RT-LAMP檢測,檢驗所建方法的重復(fù)和穩(wěn)定性。

      1.8 臨床樣品及符合性試驗

      對臨床采集25份仔豬腹瀉病料提取核酸,同時進行 RT-LAMP和 RT-PCR 檢測,并對實驗結(jié)果進行陽性檢出率和符合率計算。

      2 結(jié)果

      2.1 LAMP 反應(yīng)體系的建立和條件的優(yōu)化

      LAMP反應(yīng)結(jié)束擴增后,擴增產(chǎn)物經(jīng) 1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果表明加入TGEV cDNA 樣品反應(yīng)液有特異性的梯狀條帶,陰性對照則無條帶出現(xiàn)(圖 1),擴增序列與預(yù)期結(jié)果 200 bp 一致。

      圖1 豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測結(jié)果,M:DNA Marker;1:RT-LAMP 產(chǎn)物;2:陰性對照

      通過對 RT-LAMP 反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)體系為25 μl:10 μmol/L 外引物 F3 和 B3 各1 μl,10 μmol/L 內(nèi)引物 FIP和 BIP 各 1.5 μl,10 mmol/L dNTPs 為 0.7 μl,5 M/L Betaine 為0.8 μl,10×Thermo Buffer 為 2.5 μl,Bst DNA(8000U/ml)聚合酶為 6 u,模板2μl,用去離子水補足25 μl。反應(yīng)條件為:61 ℃45min;80℃ 2 min,優(yōu)化結(jié)果如(圖 2)所示。

      2.2 LAMP 的敏感性

      將含 2.65×106起始拷貝數(shù) TGEV cDNA 樣品進行 10 被梯度稀釋,運用優(yōu)化的 LAMP 方法和 PCR 方法同時進行檢測,LAMP方法檢測為陽性的最低起始拷貝數(shù)為 26.5 個拷貝(圖3),而PCR 方法檢測為陽性的最低拷貝數(shù)為 2650 個拷貝,說明 LAMP靈敏性比 PCR 要高出 100 倍。

      2.3 RT- LAMP 的特異性

      以 TGEV-Q2016 cDNA 樣品為陽性對照,分別擴增 TGEVHX、PEDV、PDCoV、PRoV 提取制備的核酸樣品,結(jié)果表明只有TGEV-Q2016 株和 TGEV-HX 株擴增出特異性的梯度條帶,其他病毒樣品與陰性對照相同無特異性條帶出現(xiàn)(圖 4)。

      圖2 LAMP 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

      圖3 LAMP反應(yīng)敏感性檢測結(jié)果

      圖4 LAMP 特異性試驗檢測結(jié)果

      2.4 LAMP 重復(fù)性和穩(wěn)定性

      取不同代次以及同一代次的TGEV-Q2016 株細胞傳代回收樣品,提取病毒 RNA 進行反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA,然后進行LAMP檢測,結(jié)果顯示同一反應(yīng)下不同代次 TGEV 樣品無明顯差異;相同代次樣品反復(fù)檢測結(jié)果同樣無明顯差異(圖 5)。

      圖5 LAMP重復(fù)性與穩(wěn)定性檢測結(jié)果

      2.5 臨床樣品檢測

      將本實驗室 2016 年收集 25 份仔豬腹瀉糞便提取 RNA,同時進行 RT-LAMP 和 RT-PCR 擴增,結(jié)果如表 2 顯示 25 份樣品中RT-LAMP 共檢測出 8 份陽性,而 RT-PCR 只檢測出 5 份陽性,并且 RT-PCR 陽性檢出樣品的 RT-LAMP 檢測結(jié)果也是陽性,其符合率為 100 %,而且 RT-LAMP的檢出率明顯高于 RT-PCR 與敏感性實驗結(jié)果相符。

      表2 RT-LAMP 和 RT-PCR 方法樣品檢測結(jié)果比較

      3 討論

      LAMP 方法作為一種新型快速高效的檢測方法,LAMP 技術(shù)是在傳統(tǒng)的 PCR 基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種理想的手段,其利用 BstDNA聚合酶和根據(jù)不同靶序列設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引物,特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域,啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)。其特點是只需要一個恒定溫度就能擴增反應(yīng)、檢測時間短、操作簡便、靈敏性高、特異性強等特點,因而該方法用于病毒、細菌、真菌的快速靈敏特異檢測和其他方面的檢測已經(jīng)成為熱點,具有更寬闊的應(yīng)用前景。

      TGEV 可引起 2 周齡以內(nèi)仔豬發(fā)生以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和高度致死率為特征的急性、高度接觸性傳染病。該病自首次報道以來,目前呈世界性分布,季節(jié)性暴發(fā)流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究建立了一種反應(yīng)時間短、特異性強、靈敏度高、判定容易、操作簡便、成本低廉可應(yīng)用于 TGEV 快速檢測的新方法,與常規(guī)核酸檢測方法相比具有明顯的優(yōu)點,首先該方法成本低廉、方法簡單,僅利用 Bst DNA polymerase 在 61 ℃ 恒溫于水浴鍋中就可完成反應(yīng),無需高精度儀器的輔助;其次是反應(yīng)時間短,整個試驗只需要 2 h 左右,與常規(guī) PCR 反應(yīng)相比至少減少 2.5 h 以上,大大縮短了檢測時間;其次其特異性好,對其它病原呈陰性反應(yīng);最后其靈敏度高,是常規(guī) PCR 靈敏度的 100倍。該方法同時具有比傳統(tǒng) PCR 更高的靈敏性,比熒光定量 RTPCR 更方便的特性,完全能夠滿足基層檢驗工作的需要。該檢測方法的建立將降低獸醫(yī)基層檢測單位的檢測難度、檢測時間,擺脫檢測人員素質(zhì)要求和檢測儀器要求的束縛,為該病的防制提供檢測理論基礎(chǔ),有望發(fā)展為臨床檢測的有效手段而被推廣。

      猜你喜歡
      特異性引物病毒
      DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
      高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
      病毒
      感冒病毒大作戰(zhàn)
      幼兒園(2021年16期)2021-12-06 01:06:36
      SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
      病毒,快滾開
      感冒病毒
      精確制導(dǎo) 特異性溶栓
      BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
      火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
      河津市| 拉萨市| 遵化市| 黑水县| 湘乡市| 嵊泗县| 鹿泉市| 枣阳市| 石首市| 霞浦县| 岑溪市| 秀山| 观塘区| 贵州省| 镇赉县| 固原市| 富平县| 舒兰市| 昌都县| 房山区| 石台县| 六盘水市| 嫩江县| 桑植县| 晋中市| 青川县| 宁河县| 班玛县| 文昌市| 潞城市| 兴化市| 日喀则市| 柘荣县| 郸城县| 舞钢市| 泗水县| 普格县| 托克逊县| 文成县| 谷城县| 鸡东县|