DNA條形碼技術(shù)鑒定黃頰長臂猿與白頰長臂猿

孫偉東 陳 蓉 傅兆水

(南京市紅山森林動物園管理處，南京，210028)

長臂猿科(Hylobatidae)分為4個屬(Nomascus，Symphalangus，Hylobates，Hoolock)17個種，其中我國分布有3屬6種[1]。冠長臂猿屬IUCN瀕危物種，其家族成員中的北部白頰長臂猿(Nomascusleucogenys)、南部白頰長臂猿(Nomascussiki)、黃頰長臂猿(Nomascusgabriellae)間的形態(tài)差異極小，外觀不易區(qū)分。其中，動物園飼養(yǎng)較多的黃頰長臂猿和白頰長臂猿體毛長而粗糙，雄性均以黑色為主，混有不明顯的銀色，區(qū)別僅為黃頰長臂猿面頰的兩旁從嘴角至耳朵的上方各有一塊橘紅色或黃色的毛，白頰長臂猿為白色或黃色的毛。兩個物種的雌性腹部均沒有黑色的毛，僅黃頰長臂猿雌性體毛通常為棕黃色，白頰長臂猿雌性體毛為橘黃色至乳白色。通過黃頰長臂猿和白頰長臂猿外形來區(qū)分是非常困難的，由于僅有地域隔離而沒有生殖隔離，導(dǎo)致遷地保護(hù)中出現(xiàn)了黃頰長臂猿和白頰長臂猿的雜交現(xiàn)象。由于上述原因，存在黃頰長臂猿和白頰長臂猿種間雜交等問題，長此以往，對該物種的遷地保護(hù)是極其不利的。 因此，需要借助分子遺傳學(xué)的方法輔助鑒定長臂猿的物種，以避免這一現(xiàn)象的產(chǎn)生。

mtDNA分子標(biāo)記作為一種母系遺傳的生物大分子，是研究物種內(nèi)遺傳多樣性及種上系統(tǒng)分類關(guān)系的有力工具，特別是線粒體細(xì)胞色素 C 氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit I，COI)，是目前研究種和種下水平分子系統(tǒng)的首選標(biāo)記。本文利用mtDNA物種鑒定技術(shù)，設(shè)計合成冠長臂猿屬COI序列的引物，對21只長臂猿進(jìn)行物種鑒定，NJ樹顯示2只雄性長臂猿為南部白頰長臂猿，其余19只均為黃頰長臂猿。該方法能有效區(qū)分冠長臂猿屬下的黃頰長臂猿和白頰長臂猿，為這幾個物種的遷地保護(hù)提供管理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

來自南京紅山森林動物園圈養(yǎng)條件下的21只長臂猿(基本信息見表1)，采集帶毛囊的毛發(fā)樣本放于-20℃保存。

表1 21只長臂猿基本信息Tab.1 Basic information of 21 gibbons

1.2 主要試劑與儀器

微量基因組提取試劑盒、TaqPlus MasterMix、D2000 DNA Marker、GeneGreen核酸染料購自天根生化科技(北京)有限公司。引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

梯度PCR儀購自杭州龍揚儀器公司。凝膠成像系統(tǒng)購自上海歐翔儀器公司。水平電泳儀購自北京君意東方有限公司。高速冷凍儀離心機(jī)購自上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.3 基因組DNA提取

按微量基因組提取試劑盒說明書提取長臂猿毛囊中的基因組DNA。提取后的基因組DNA樣本于-20℃保存，備用。

1.4 引物設(shè)計和篩選

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中，相近物種的COI序列進(jìn)行比對，設(shè)計出3對引物(COI F1/R1，COI F2/R2，COI F3/R3)，序列見表2，進(jìn)行PCR篩選。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

1.5 PCR擴(kuò)增

利用引物(COI F1/COI R1)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Mix 12.5 μL，COI F 0.5 μL，COI R 0.5 μL，雙蒸水6.5 μL，DNA模板5 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.6 電泳

取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在2%的瓊脂糖凝膠上電泳30 min，通過凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄結(jié)果。電泳結(jié)果中，目標(biāo)條帶大小約750—500 bp。

1.7 序列測序與分析

將PCR產(chǎn)物送至金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行克隆測序。測序獲得序列利用DNAstar軟件包中的SeqMen軟件進(jìn)行拼接，舍棄兩端低信號序列，結(jié)合測序峰圖，對序列內(nèi)部位點進(jìn)行人工校對。確定序列后，將校準(zhǔn)后的序列輸出為FASTA格式的文本文件，利用BLAST比對確認(rèn)，獲得序列為目的序列。將目的序列與黃頰長臂猿N.gab1(HQ622807.1)、黃頰長臂猿N.gab2(HQ622806.1)、北方白頰長臂猿N.leu(KC757404.1)、南方白頰長臂猿 N.siki(HQ622805.1)采用Clustalx軟件對基因序列進(jìn)行比對分析。將其比對結(jié)果轉(zhuǎn)換成Mega格式，用Mega 4軟件計算序列間堿基對差異、轉(zhuǎn)換、顛換，采用Maximum composite likelihood等模型，構(gòu)建NJ樹。NJ樹分支的置信度均采用自展法1 000次重復(fù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RCR檢測方法的建立

以長臂猿線粒體DNA為模板，用3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果引物COI F1/R1能擴(kuò)增與預(yù)期一致的特異性DNA 片段(約500 bp)(圖1)。進(jìn)一步切膠回收DNA測序，并進(jìn)行序列分析，確證2條特異性引物間的序列為COI序列(515 bp)。

圖1 COI引物建立Fig.1 COI primer establishment注：1.D2000Maker；2.引物COI F1/R1；3.引物COI F2/R2；4.引物COI F3/R3Note：1.D2000Maker.2.Primer COI F1/R1.3.Primer COI F2/R2.4.Primer COI F3/R3

2.2 COI PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用COI F1/R1對21只冠長臂猿進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出515 bp的目的條帶(圖2，圖3)。

圖2 COI PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification results of COI PCR注：1.D2000Maker；2-17.樣本1-16號Note：1.D2000Maker.2-17.Sample 1-16

2.3 進(jìn)化樹分析

測序獲得序列利用DNAstar軟件包中的SeqMen軟件進(jìn)行拼接，校對。采用Clustalx軟件對基因序列進(jìn)行比對分析。用Mega4軟件采用Maximum composite likelihood等模型，構(gòu)建NJ樹。系統(tǒng)樹分支的置信度均采用自展法1 000次重復(fù)檢驗。

圖3 COI PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The amplification results of COI PCR注：1.D2000Maker；2-6.樣本17-21號Note：1.D2000Maker.2-6.Sample 17-21

如圖4可見，長臂猿Lianlian和Dazai與N.siki在一個分支上，其余19只長臂猿均在N.gab分支上。其中，可以發(fā)現(xiàn)種群中的Dahuang家族成員(Yuanyuan，Dongzhi，Lele，Xiatian)和Erhuang家族成員(Fangfang，Yuanbao，Wuming，Yaqing)在分支上比較接近。進(jìn)化樹上，黃頰長臂猿和白頰長臂猿均有明顯的分支，能夠區(qū)分這幾個物種。

3 討論

隨著標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫的建立，基于COI基因的DNA barcode在動物分類學(xué)和生態(tài)學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用[2]。由于常采用基于形態(tài)特征的工作方式，傳統(tǒng)分類學(xué)要將這些物種納入記錄，而獲取相關(guān)知識有許多困難。在記錄新物種的工作中引入COI基因以后可以快速給物種分群，在一定條件下還可以快速判定物種樣品是否來源于已知物[3]。這種快速判斷在某些情況下顯得尤為重要。此外，因為傳統(tǒng)分類學(xué)大多數(shù)情況下有更加關(guān)注成年個體的傾向，對幼體經(jīng)常描述不夠詳細(xì)，導(dǎo)致對許多物種辨別能力不足，DNA barcode方法則沒有這種限制。另外，在缺乏形態(tài)變化的動物類群中，依賴形態(tài)特征的工作方式往往會導(dǎo)致混亂和錯誤[4]。

圖4 長臂猿NJ進(jìn)化樹Fig.4 The NJ evolution tree of the gibbons

目前，本文通過近物種COI序列進(jìn)行引物設(shè)計和篩選，建立了對黃頰長臂猿和白頰長臂猿的鑒定方法。 運用該方法對21只冠長臂猿進(jìn)行物種鑒定，NJ樹結(jié)果顯示2只雄性長臂猿在南部白頰長臂猿的分支上，同時，對其外觀進(jìn)行觀察，體毛為黑色，唯兩頰各具一大塊白毛，符合白頰長臂猿的外形特征。其余19只長臂猿與黃頰長臂猿在一個分支上，經(jīng)COI序列鑒定為黃頰長臂猿，比對其外觀，符合黃頰長臂猿特征。NJ樹上，冠長臂猿屬的各物種均有明顯的分支，能夠明顯區(qū)分。因此，將COI序列鑒定與外形特征結(jié)合，能準(zhǔn)確對黃頰長臂猿和白頰長臂猿進(jìn)行物種鑒定。

根據(jù)物種鑒定結(jié)果，建議將這2只白頰長臂猿與黃頰長臂猿分開飼養(yǎng)管理，防止因種間雜交造成的瀕危物種基因污染。此外，這2只白頰長臂猿(Dazai和Lianlian)已成年，可以考慮為其引進(jìn)雌性白頰長臂猿進(jìn)行配對繁殖。

種群管理對物種保護(hù)非常重要，其管理的目標(biāo)應(yīng)是維持種群的多樣性達(dá)到可持續(xù)發(fā)展。隨著技術(shù)水平的推進(jìn)，管理種群不應(yīng)只停留在宏觀的記錄和調(diào)控上，應(yīng)逐步運用遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)等原理，結(jié)合分子技術(shù)來了解和運用表觀現(xiàn)象后的科學(xué)原理。尤其是大種群或群居動物，作為在物種保護(hù)中起重要作用的動物園，需要對物種的過去(來源——是否有親緣關(guān)系)、現(xiàn)在(種或亞種類型、種群的遺傳多樣性)有充分的了解，才能對其未來(是否有足夠的遺傳多樣性來對抗疾病、來繁殖配對等)進(jìn)行規(guī)劃。這些都必須而且一定要建立在科學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上。