肝臟特異性Pten基因敲除小鼠模型的制備及鑒定

劉宏揚(yáng) 黃 麗 張昆麗 翁長江* 楊玉瑩

（1.長江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 基礎(chǔ)免疫創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069）

Pten，又稱為MMACI基因或者TEP1[1]，是一個(gè)重要的抑癌基因，該基因具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。Pten基因定位于染色體10q23，基因編碼403個(gè)氨基酸，由N端180個(gè)氨基酸的催化區(qū)、中部165個(gè)氨基酸的C2區(qū)和C端50個(gè)氨基酸的尾區(qū)組成[2-5]。Pten基因在體內(nèi)幾乎所有組織器官中廣泛表達(dá)，參與了機(jī)體內(nèi)的多種生理功能。Pten與多種蛋白結(jié)合對(duì)PIP3、MAPK及FAK等通路有調(diào)控作用。Pten通過調(diào)控PIP3的去磷酸化影響細(xì)胞增殖與凋亡[6]；通過調(diào)控黏著斑激酶（FAK）的磷酸化作用抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[7]。有研究表明，Pten通過抑制促細(xì)胞分裂素激活的蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制細(xì)胞的生長和分化[8，9]。

Pten基因異常表達(dá)與人類多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[10]。Pten失活導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡失衡，使腫瘤細(xì)胞失控性的生長、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[11]。Yu等研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Pten的表達(dá)顯著低于非腫瘤組織[12]。最近研究表明，肝癌組織中Pten基因的缺失或失活與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等功能密切相關(guān)[4，13]。

本課題利用Cre/Loxp條件基因敲除技術(shù)構(gòu)建肝臟內(nèi)特異性敲除Pten基因的小鼠模型，為在體內(nèi)研究Pten基因在肝臟相關(guān)疾病中所起的作用提供研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J品系的Ptenflox/flox小鼠來自于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所楊曉教授，肝臟特異表達(dá)Cre重組酶的工具鼠購買自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。所有的動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SPF級(jí)）進(jìn)行。所有小鼠均飼養(yǎng)于12h/12 h 光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

圖1 肝臟特異性Pten基因敲除小鼠模型的打靶策略（1A）與流程圖（1B）

1.1.2 主要試劑

NaCl、EDTA、Tris base、SDS、瓊脂糖粉等化學(xué)試劑購自sigma公司；Proteinase K購自Thermo Fisher公司；2 × Ex Taq PCR Mix酶、DNA maker DL2000 購自寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Premix EX Taq II、PrimeScriptTMRT reagent kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司；GAPDH單克隆抗體，Pten多克隆抗體購自武漢三鷹公司；Anti-Mouse IgG（H+L）DyLight? 800-Labeled（042-07-18-06）購自美國KPL公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

低溫高速離心機(jī)購于Beckman公司；小型臺(tái)式離心機(jī)購于Eppendorf公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購于Thermo公司；恒溫水浴鍋購于Thermo公司；熒光定量PCR儀Aligent Mx3005P購自美國Aligent公司；紅外掃膜儀購自美國Licor公司。

1.2 方法

1.2.1 肝臟特異性Pten基因敲除小鼠模型構(gòu)建策略

Ptenflox/flox小鼠打靶策略如圖1A所示，在Pten基因的4號(hào)和5號(hào)外顯子兩端插入Loxp位點(diǎn)?；贑re/Loxp系統(tǒng)原理，Ptenflox/flox小鼠與肝臟特異性表達(dá)Cre重組酶小鼠（Alb-Cre）交配，Cre重組酶特異性識(shí)別Loxp位點(diǎn)，通過同源重組實(shí)現(xiàn)靶基因在肝臟內(nèi)特異性敲除。具體流程為：首先將Ptenflox/flox小鼠與Alb-Cre小鼠進(jìn)行交配，篩選出F1代，基因型為Ptenflox/+/Alb-Cre小鼠。F1與Ptenflox/flox小鼠交配，篩選出F2代基因型為Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠。F2代小鼠與Ptenflox/flox小鼠交配，獲得F3代基因型為Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠（肝臟特異性基因敲除小鼠）和Ptenflox/flox小鼠（實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠）（圖1B）。

1.2.2 肝臟特異性Pten基因敲除小鼠的基因型鑒定

對(duì)5周齡左右的小鼠進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記，對(duì)應(yīng)耳標(biāo)號(hào)剪下約2 mm左右的鼠尾，置于1.5 ml EP管內(nèi)，加入500 μl組織裂解液（1 M Tris-HCL pH 8.0，0.5 M EDTA pH 8.0，3 M NaCl，10% SDS）和1μl蛋白酶K（10 mg/mL）。56 ℃水浴消化過夜。第二天將樣品室溫放置10 min，12000 rpm/min離心15 min，取上清400 μl加入等量異丙醇上下反復(fù)顛倒混勻，待析出白色絮狀沉淀后，12000 rpm/min離心，棄上清，75%酒精洗一遍后，加雙蒸水溶解。依據(jù)打靶策略設(shè)計(jì)的基因型鑒定引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μl）：Ex Taq Mix 10μl，引物各1 μl，模板1 μl，ddH2O 7 μl。Cre基因PCR擴(kuò)增條件：98℃ 2 min，98℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 30 s，（35 Cycle），72℃ 5 min。Flox基因擴(kuò)增條件：98 ℃ 2 min，98℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，（35 Cycle），72℃ 5 min。取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.2% 瓊脂糖凝膠核酸電泳鑒定肝臟特異性Pten基因敲除小鼠基因型。

1.2.3 RNA提取及Real-Time PCR檢測(cè)

圖2 Pten基因敲除小鼠基因型鑒定

圖3 小鼠肝臟、肺臟以及腎臟組織中Pten基因 mRNA水平檢測(cè)

圖4 小鼠肝臟、肺臟以及腎臟組織中Pten蛋白表達(dá)水平鑒定

選取6周齡小鼠，依據(jù)Trizol法提取RNA的步驟進(jìn)行小鼠肝臟、肺臟以及腎臟總RNA的提取，將濃度稀釋成50 ng/μl的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備成20μl體系的DNA樣本，作為 熒光定量PCR反應(yīng)模板，用于檢測(cè)肝臟組織中Pten基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，鑒定敲除效率。Real-Time PCR 使用的Pten基因上游引物為：5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCCGTAC-3'，下游引物為：5'-CCGCTCGAGCAGTCGCTGCAACCATCCA-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物為：5- AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3，下游引物為：5- CAACAATCTCCACTTTGCCACTG -3。反應(yīng)體系（20 μl）：2× SYBR Premix EX Taq Ⅱ 10 μl，PCR Forward Primer（10 μm）1 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）1 μl，DNA 模板2 μl，滅菌蒸餾水6 μl。反應(yīng)條件：Step1，95 ℃ 30 s；Step2，95℃ 5 s；60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，（35 Cycle）；Step3：Melt Curve。

1.2.4 小鼠組織總蛋白提取及Western Blot檢測(cè)

選取經(jīng)過PCR驗(yàn)證后的6周齡Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠與Ptenflox/flox小鼠，取其不同組織。使用強(qiáng)RIPA組織裂解液提取小鼠肝臟、肺、腎臟組織總蛋白。取大約100mg組織于研缽中，邊加液氮邊研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中加入1 ml RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000 rpm/min 4℃ 離心20min，吸取裂解上清，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入5 × SDS-PAGE Loading Buffer，100℃煮沸10 min，樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，濕轉(zhuǎn)至NC膜上；5 %脫脂乳室溫封閉，分別以抗Pten或抗GAPDH mAb（1：1 000）為一抗，以羊抗鼠Goat anti-rabbit IgG（H+L）（1∶2 0000）作為二抗，通過紅外掃膜儀進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 Ptenflox/ flox/Alb-Cre小鼠基因型鑒定

提取Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠與Ptenflox/flox小鼠交配產(chǎn)生的7只子代小鼠的基因組DNA，分別使用 Flox基因和Cre基因特異性引物對(duì)小鼠的基因型進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果如圖2所示，從第2、3、5、6、7只小鼠的基因組DNA中擴(kuò)增出512bp 的 Cre 基因 片段（圖2A），7只小鼠的基因組DNA中均擴(kuò)增出300 bp 的 flox基因 片段（圖2B）。由此判定，第2、3、5、6、7只小鼠為Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠，而第1和第4只小鼠為Ptenflox/flox小鼠。

表1 基因型鑒定的引物信息2

2.2 mRNA水平檢測(cè)

分別提取Ptenflox/flox/Alb-Cre和Ptenflox/flox基因敲除小鼠的肝臟、肺臟、腎臟總RNA，用Real-time PCR方法檢測(cè)這三個(gè)組織中Pten的mRNA水平。結(jié)果如圖3所示，與Ptenflox/flox小鼠相比，Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠肝組織中Pten mRNA水平顯著降低（P<0.0001）；而肺臟和腎臟組織中Pten的mRNA水平?jīng)]有明顯變化。

2.3 蛋白水平鑒定

分別提取Ptenflox/flox/Alb-Cre和Ptenflox/flox的肝臟、肺臟、腎臟組織總蛋白，用Western Blot方法檢測(cè)Pten的蛋白水平。結(jié)果如圖4所示，與Ptenflox/flox小鼠相比，Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠肝臟中Pten蛋白的表達(dá)量顯著降低，而 Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠與Ptenflox/flox小鼠的肺及腎臟中Pten蛋白表達(dá)量無差異，由此說明 Pten基因僅在肝臟組織中被敲除。

3 討論

最近幾年來，基因敲除技術(shù)迅速發(fā)展，基因敲除模型被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域[14]。但是基因敲除小鼠的某些基因缺失可能造成生長發(fā)育或生殖功能障礙，不易獲得純合型后代[15]。因此構(gòu)建條件基因敲除小鼠模型，使某段基因在動(dòng)物體內(nèi)的特定組織器官內(nèi)失活，是研究該基因在特定組織器官內(nèi)功能最為有效的方法。條件性基因敲除是通過把兩個(gè)LoxP位點(diǎn)插入到目的基因的一個(gè)或幾個(gè)重要外顯子的兩端以制備出有兩個(gè)LoxP位點(diǎn)Knockout-floxed小鼠[16]，Knockout-floxed小鼠與組織特異性表達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)行雜交后，可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而該基因在其它組織或細(xì)胞表達(dá)正常[17]。

利用Cre-Loxp基因敲除系統(tǒng)，在Pten基因的4號(hào)和5號(hào)外顯子外側(cè)插入了Loxp位點(diǎn)，得到Ptenflox/flox小鼠并與特異性表達(dá)Cre酶的工具鼠交配，經(jīng)過多代次的繁育，成功獲得Pten基因敲除小鼠Ptenflox/flox/Alb-Cre。

通過對(duì)肝臟特異性Pten基因條件敲除小鼠的生長繁殖情況的觀察，我們發(fā)現(xiàn)Pten基因條件敲除小鼠的生長情況與對(duì)照組相比并無顯著差異，小鼠繁殖能力良好，子代生長發(fā)育情況正常。采用Genotyping的方法對(duì)5周左右的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，成功篩選出Ptenflox/flox/Alb-Cre和Ptenflox/flox小鼠。與Ptenflox/flox小鼠相比。Ptenflox/flox/Alb-Cre 小鼠肝臟組織中Pten的mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均有顯著降低，表明我們成功得到Pten 肝臟特異性條件基因敲除小鼠，為探究Pten基因在肝臟疾病中的的作用提供了重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>