革蘭染色涂片檢查及結(jié)果影響因素淺析

李飛

【摘 要】盡管臨床微生物實(shí)驗(yàn)室因新技術(shù)的不斷出現(xiàn)而發(fā)生巨大變化，但作為傳統(tǒng)技術(shù)的革蘭染色仍然具有相當(dāng)重要的作用。它可先于培養(yǎng)結(jié)果，迅速地為臨床醫(yī)生提供潛在病原菌信息，進(jìn)而為經(jīng)驗(yàn)性治療方案指出方向。本文將重點(diǎn)介紹革蘭染色涂片檢查的工作原理和方法，并簡(jiǎn)單論述影響革蘭染色結(jié)果的相關(guān)因素，以提高廣大群眾的認(rèn)知，積極配合臨床檢驗(yàn)工作，也有助于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【關(guān)鍵詞】革蘭染色;涂片檢查;操作步驟;影響因素

【中圖分類號(hào)】R446.5【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1672-3783（2019）08-03--01

1 案例介紹

某患者，男，34歲，因排尿刺痛和排尿困難2天，到我院泌尿外科就診。檢查見：尿道口紅腫并伴有黏稠膿性分泌物，取膿性分泌物涂片后送檢驗(yàn)科微生物室檢查。革蘭染色后，鏡下見大量白細(xì)胞及革蘭陰性雙球菌，可見細(xì)胞內(nèi)吞噬形態(tài)，報(bào)告為“涂片查見革蘭陰性雙球菌（細(xì)胞內(nèi)）”，同時(shí)尿常規(guī)結(jié)果顯示白細(xì)胞（WBC）陽性，尿沉渣結(jié)果顯示W(wǎng)BC 78.6 /μL（正常參考值0～26）。臨床考慮為急性淋菌性尿道炎，進(jìn)行對(duì)癥治療，輸液消炎。

用藥治療5d后癥狀顯著緩解，又到本市另一家三甲醫(yī)院進(jìn)行尿道分泌物革蘭染色涂片檢查，結(jié)果為 “涂片未查見革蘭陰性雙球菌”?；颊邔?duì)此表示不理解，用藥治療后癥狀雖有緩解，但其仍存有一定的不適癥狀，為何革蘭染色涂片檢查未見有革蘭陰性雙球菌。檢驗(yàn)人員耐心解釋，淋病奈瑟菌感染后起始癥狀為急性尿道炎，經(jīng)有效藥物治療后可使病原菌減少或消失，從而病情得到控制。但機(jī)體處于恢復(fù)期，病原體即使殺滅后也會(huì)因?yàn)榇x產(chǎn)物反應(yīng)而出現(xiàn)某些不適癥狀，需繼續(xù)進(jìn)行鞏固治療。革蘭染色涂片檢查顯示陰性表示病情已有好轉(zhuǎn)，治療有效。

究竟什么是革蘭染色涂片檢查呢？下文將逐一論述。

2 革蘭染色涂片檢查概述

2.1 革蘭染色的工作原理

革蘭染色法是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立，直到現(xiàn)今，其仍是細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中廣泛應(yīng)用的一種鑒別染色法。該方法主要用于細(xì)菌分類與鑒定，通過初染、媒染、脫色復(fù)染步驟使細(xì)菌與背景形成較為鮮明的對(duì)比，這就有助于清楚地觀察到細(xì)菌的結(jié)構(gòu)、排列方式、形態(tài)特征等，還可以根據(jù)菌體著色情況的不同將細(xì)菌分為革蘭陽性菌（菌體呈紫色）和革蘭陰性菌（菌體呈紅色）兩種，故其在初步識(shí)別細(xì)菌，縮小診斷范圍方面具有不可替代的作用[1]。其次，該方法也可為藥物選擇提供參考依據(jù)，這是因?yàn)楦锾m陰性菌、革蘭陽性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異較大，其治療所用的抗生素也不盡相同，故進(jìn)行革蘭染色檢查有助于臨床治療用藥。

2.2 革蘭染色檢驗(yàn)步驟

（1）涂片：用接種環(huán)蘸取少量無菌生理鹽水到潔凈的玻片上，隨后用接種環(huán)取少量經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)的菌落與生理鹽水混勻制作成涂片。

（2）干燥：在室溫下將涂片進(jìn)行干燥處理。

（3）固定：標(biāo)本面朝上，手持玻片的一側(cè)在酒精燈的火焰外側(cè)來回移動(dòng)3～4次，玻片的溫度以手背皮膚觸及玻片背面不燙手為宜，隨后在室溫中放置冷卻。

（4）染色（快速革蘭染色法Baso試劑）：①初染：將檢測(cè)的涂片固定后，在涂片的菌膜上滴加適量的龍膽紫染液，染色10s，水洗，甩干;②媒染：在涂片菌膜表面滴加適量的碘液，染色10s，水洗，甩干;③脫色：滴加數(shù)滴脫色液，輕輕搖動(dòng)涂片以進(jìn)行脫色，10s后水洗，甩干;④復(fù)染：加沙黃染色液復(fù)染10s，水洗;⑤在空氣中晾干進(jìn)行鏡檢。

3 影響革蘭染色結(jié)果的相關(guān)因素

3.1 細(xì)菌因素

抗菌藥物影響：細(xì)菌培養(yǎng)所用標(biāo)本應(yīng)在使用抗菌藥物之前采集，若細(xì)菌已受抗菌藥物作用，則其形態(tài)大小排列及染色性均可發(fā)生改變。

（2）菌齡因素：細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過程中，只有在生長(zhǎng)旺盛且各種生物特征均穩(wěn)定階段的細(xì)菌能夠真實(shí)反映細(xì)菌的生化反應(yīng)及染色性情況。若細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，菌齡過大，則細(xì)胞衰老，各種生命特征趨于衰敗，勢(shì)必影響涂片染色結(jié)果各項(xiàng)相關(guān)檢查準(zhǔn)確性[2]。

3.2 涂片質(zhì)量因素

（1）涂片厚度：當(dāng)涂片太厚時(shí)細(xì)菌無法分開，在脫色時(shí)由于涂片太厚導(dǎo)致第一步染上的龍膽紫顏色無法完全脫去，這就會(huì)使染色結(jié)果出現(xiàn)著色不均的情況，革蘭陰性菌可能出現(xiàn)紫色，從而影響結(jié)果判斷。

（2）干燥固定：涂片的固定不僅殺死細(xì)菌，改變其細(xì)胞壁的滲透性，還可讓細(xì)菌黏附在載玻片上，使其維持原有的形態(tài)。準(zhǔn)確的涂片固定方法是把干燥的涂有細(xì)菌的載玻片以合適的溫度進(jìn)行烘烤。若在干燥或固定過程中載玻片干燥溫度過高或火烤時(shí)

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間過長(zhǎng)，則會(huì)影響細(xì)菌的滲透性，導(dǎo)致菌體染色結(jié)果出現(xiàn)異常。

（3）脫色時(shí)間掌握不當(dāng)：一般情況下，陰性菌的滲透性較大，易脫色;而陽性菌的滲透性較低，不易被脫色。然而，在兩種菌體固定時(shí)間相同的條件下，若脫色時(shí)間過短會(huì)出現(xiàn)革蘭陰性菌染上龍膽紫溶液后未能完全脫色，而誤判為陽性菌;若脫色時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)讓一些革蘭陽性菌脫色過度，呈現(xiàn)陰性菌的著色特征，影響結(jié)果判定。因此，在實(shí)際脫色操作中需根據(jù)涂片的厚度靈活掌握脫色時(shí)間，快速革蘭染色一般為10s，可根據(jù)室溫及涂片厚度情況靈活掌握。

3.3 染液因素

（1）初染的龍膽紫溶液使用不對(duì)：若使用的龍膽紫溶液濃度過高，會(huì)使其不容易脫色，這就有可能使陰性菌被誤認(rèn)為是陽性菌。

（2）媒染的碘液放置時(shí)間過長(zhǎng)：選擇碘液作為媒染劑是因?yàn)槠淠軌蛱岣呷疽号c細(xì)菌的親和力。但在染色過程中使用了放置時(shí)間較長(zhǎng)的碘液進(jìn)行媒染，會(huì)影響其媒染作用，導(dǎo)致染劑與細(xì)菌的結(jié)合不牢固，易脫色，造成陽性菌誤認(rèn)為陰性菌。

（3）脫色使用的脫色液濃度不當(dāng)：脫色液濃度不同則脫色效果不同，以常用的Baso快速革蘭染液來說，厚薄適宜的涂片滴加脫色液后輕輕搖動(dòng)玻片至無紫色脫出即可，時(shí)間大約幾秒到10s.若脫色液濃度偏低則應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)脫色時(shí)間。

3.4 溫度對(duì)染色的影響

一般來說，室溫升高則革蘭氏染色各步操作均可適當(dāng)縮短時(shí)間，而室溫低于正常時(shí)則應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)各步時(shí)間，若缺乏經(jīng)驗(yàn)，可增加質(zhì)控片作為染色參考來控制染色效果。

4 總結(jié)

革蘭氏染色是微生物檢測(cè)過程中常用到的基本技能之一，也是輔助臨床鑒別細(xì)菌種類的基礎(chǔ)方法之一。由于細(xì)菌的結(jié)構(gòu)存有差異，故通過染色可形成不同的染色效果，因此充分了解染色性能以及染色結(jié)果的影響因素，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，有助于細(xì)菌的鑒別診斷以及臨床用藥。

參考文獻(xiàn)

寧丹.淺析微生物標(biāo)本培養(yǎng)前涂片革蘭染色鏡檢的臨床研究意義[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2018，7（1）58-60.

王芳，宋瑛琳，田明.革蘭氏染色結(jié)果的影響因素及原因分析[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2009，6（1）：104-106.