Cfap43基因缺陷小鼠組織病理學研究

余怡，王家雄，馬勇，許偉偉，王瑋，李紅，楊慎敏

(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

嚴重弱精子癥除環(huán)境、生活方式等特異性因素外[1]，與精子尾部超微結構異常有關，而這些超微結構的異常往往提示患者自身存在著遺傳缺陷，如原發(fā)性纖毛運動障礙(primary ciliary dyskinesia，PCD)、精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella，MMAF)、成人型多囊腎(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)等。其中PCD與ADPKD患者的遺傳缺陷不僅影響了精子質量與男性生育力，更關鍵的是這些缺陷對其他臟器的嚴重不良影響。PCD患者常伴有慢性呼吸道癥狀，而ADPKD患者雙側腎臟出現(xiàn)廣泛的囊性改變。MMAF患者表型與PCD類似，其精子在光學顯微鏡下表現(xiàn)尾部短而粗、僵直等特征，早年間學者將其稱為“短尾”(short tail)、“殘段尾”(stump tail)或纖維鞘發(fā)育不良(dysplasia of the fibrous sheath，DFS)[2-3]，MMAF患者遺傳缺陷的研究較PCD與ADPKD少。本課題組曾報道Cfap43基因缺陷的MMAF[4]，而近來也有MMAF新致病突變基因的報道[5]。本研究通過構建Cfap43缺陷的小鼠，對其精子表型以及生殖系統(tǒng)及非生殖系統(tǒng)的臟器進行了組織病理檢查，旨在探討Cfap43在弱精子癥發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、實驗動物與儀器試劑

1.實驗動物：8周齡C57BL/6品系雄性小鼠(野生型)3只(購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，SPF級)。

2.主要試劑儀器：引物(南京金思瑞)；核酸提取試劑盒(BIMAKER，美國)；胚胎緩沖液(GMOPS，Vitrolife，瑞典)；2.5%戊二醛電鏡固定液(Life Science，美國)；Boin固定液(Life Science，美國)；環(huán)氧樹脂Epon 812(SPI，美國)；PCR儀(Biometra Tadvanced 96，德國)；Sanger測序儀(ABI 3500，美國)；光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100，日本)；透射電鏡(TECNAI 10，Philips，荷蘭)。

二、實驗方法

1.基因敲除小鼠構建：參照本課題組之前的方法[4]，使用CRISPR/Cas9技術生成了Cfap43敲除小鼠。

2.基因型鑒定：8周齡小鼠剪尾，使用核酸提取試劑盒提取鼠尾DNA，參照試劑盒說明書，配置20 μl體系后行PCR。引物序列：F：5’-TCCTTTCTTTTTTGATGGCTCTAGC-3’；R：5’-TTCTATCTTCATGGGCTTCTTTGCT-3’。反應產物行Sanger測序后，使用FINCHTV軟件與NCBI網(wǎng)站分析測序結果。

3.精子形態(tài)檢測：胚胎緩沖液37℃預熱，將Cfap43(-/-)小鼠與WT小鼠解剖取出附睪剪碎置入EP管，加1 ml預熱的緩沖液，37℃水浴10 min，使精子游離，鑷子夾去附睪組織，400g離心15 min，棄上清，加入PBS洗滌，離心沉淀進行精子涂片，剩余沉淀加入2.5%戊二醛固定過夜，PBS緩沖液沖洗2次，每次15 min，之后經(jīng)過1%鋨酸后固定1 h，再經(jīng)過PBS緩沖液沖洗2次，每次15 min，2%醋酸鈾染色，乙醇逐級脫水，100%丙酮置換，用環(huán)氧樹脂Epon 812包埋，切片機超薄切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，最后在透射電鏡下觀察精子尾部超微結構。

4.組織病理學檢測：解剖Cfap43(-/-)小鼠與WT 小鼠，取肝、脾、肺、腎、腦、小腸，4%多聚甲醛固定過夜，睪丸、附睪用Bouin固定液固定過夜。經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，比較病理學差異。腎、小腸的電鏡檢測過程同上述精子的電鏡檢測過程。

結 果

一、小鼠基因型鑒定

按照人類的表型，我們通過CRISPR/Cas9技術構建了Cfap43基因第20號外顯子上的一個2 bp的刪除，從而導致移碼突變并終止了Cfap43 的轉錄，Sanger測序對小鼠基因型鑒定，與構建模型吻合(圖1)。

A：在Cfap43上構建了2 bp的刪除(紅色)；B：2 bp的刪除造成的移碼突變直接導致了轉錄的提前終止，cDNA中的終止子用*表示；C：Sanger測序鑒定小鼠基因型，與構建方案吻合，2 bp缺失的位置如方框所示圖1 Cfap43缺陷小鼠構建和鑒定

圖2 兩組小鼠精子形態(tài)學結果(HE染色，×40)

二、兩組小鼠的精子形態(tài)

WT小鼠精子的頭部呈鐮刀狀，鞭毛較長。與WT小鼠相比，Cfap43基因缺陷小鼠精子尾部則出現(xiàn)短、粗、卷曲甚至缺失等異常(圖2)。透射電鏡下觀察，兩組小鼠精子頭部差異不明顯，但尾部超微結構顯示：WT小鼠精子纖維鞘排列整齊，內部中央微管與外周微管呈現(xiàn)經(jīng)典的“9+2”結構；而Cfap43(-/-)小鼠，精子尾部出現(xiàn)程度不一的結構紊亂，如纖維鞘的增厚，纖維鞘、外周致密纖維、微管的排列異常與數(shù)目異常等(圖3)。

三、兩組小鼠各組織病理學特征

生殖系統(tǒng)方面，WT小鼠與Cfap43(-/-)小鼠附睪內的精子數(shù)無明顯差異。WT小鼠附睪內精子發(fā)育成熟，有明顯的正常尾部鞭毛(圖4A)，而Cfap43(-/-)小鼠附睪內成熟精子較少，且精子尾部出現(xiàn)粗、短等明顯的MMAF表型(圖4C)；睪丸內，WT小鼠睪丸的各級生精細胞排布整齊，有較多正常的長形精子(圖4B)，而Cfap43(-/-)小鼠生精細胞精子鞭毛發(fā)育異常，未見正常的長形精子，但精子頭部的變形和濃縮未見明顯異常，可見正常殘余體(residual body，RB)的存在(圖4D)。

Cfap43(-/-)小鼠的肝臟組織與WT組相比無明顯差異，肝小葉完整，中央靜脈存在，肝內膽管未見明顯擴張，肝細胞未見明顯充血、水腫，肝臟未見纖維化；Cfap43(-/-)小鼠的脾臟組織白髓與紅髓結構正常，小梁間血管排列緊密，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的肺臟組織，鏡下可見各級支氣管、肺泡管、肺泡及肺泡囊結構整齊，肺泡內未見明顯滲出，肺間質未見明顯炎癥細胞浸潤，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的腎臟組織腎小體與腎小管結構完整，排列整齊，未見明顯充血、水腫、纖維化，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的大腦皮質與海馬體排列結構正常，未見明顯神經(jīng)細胞萎縮等異?，F(xiàn)象，與WT組相比無明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的小腸組織的各層結構排列整齊，腺體無明顯萎縮，管腔見較多的環(huán)形皺襞與絨毛，與WT組相比無明顯差異(圖5)。

圖3 兩組小鼠精子的透射電鏡圖

★示附睪內正常鞭毛精子；▲示附睪內MMAF表型；示正常長形精子；→示睪丸生精細胞鞭毛異常；?示精子頭部變形和濃縮；示正常殘余體圖4 小鼠睪丸與附睪病理圖片(HE染色，附睪×50；睪丸×80)

透射電鏡下觀察，兩組小鼠的小腸腸腔表面均分布有緊密排列的正常微絨毛結構，兩者對比未見明顯差異。兩組小鼠的腎小管(近曲小管)有著緊密排列的的微絨毛，兩者對比亦未見明顯差異(圖6)。

A：肝、肺、腎組織(HE染色，×20).B：腦組織(HE染色，×5)及脾、小腸組織(HE染色，×10)圖5 兩組小鼠各組織切片病理結果

圖6 兩組小鼠部分非生殖器官的電鏡圖

討 論

纖毛/鞭毛組織在人體內廣泛分布于聽覺器官、視覺器官、呼吸道上皮、肝臟、腎臟、輸卵管、睪丸組織等，其在各組織內的作用有所不同[6]。哺乳動物通過纖毛運輸來實現(xiàn)視覺色素的更新，因此纖毛組織的受損會影響視覺功能。氣管與支氣管上皮細胞表面存在著許多纖毛柱狀上皮，這些纖毛規(guī)律地擺動能夠及時清除異物組織及粘液[7]。肝臟、腎臟等部分實質器官中，纖毛組織能夠起到調控液體流動的作用，當相關基因突變時，纖毛的這種調控機制出現(xiàn)紊亂，引發(fā)器官的囊性病變[8]。在輸卵管中，纖毛組織在性激素的調控下，周期性地發(fā)生擺動，加速卵子或受精卵的移動。在睪丸組織內，鞭毛作為精子的重要組成，是精子運動不可缺少的部分，任何影響精子鞭毛結構的基因突變，均可引起精子活動力的下降甚至導致精子不活動[9]。

MMAF是一類鞭毛發(fā)育異常引起的功能性疾病，主要表現(xiàn)為精子尾部的粗、短、卷曲等形態(tài)異常，電子顯微鏡下觀察，整個精子鞭毛組裝均出現(xiàn)異常[10]，包括纖維鞘、線粒體鞘的發(fā)育不良，微管的缺失與排列異常，外周致密纖維的數(shù)目與排列異常等[11]。本課題組通過全外顯子組測序的方法鑒定出中國MMAF患者的疾病相關基因Dnah1、Ccdc39、Cfap43、Cfap44和Cfap65[4]。此后在國際上報道了Cfap43導致的MMAF新病例。據(jù)目前文獻來看，Cfap43是除DNAH1之外MMAF最為常見的致病基因，而Cfap43的功能尚不完全明確。Coutton等[12]對MMAF的研究中發(fā)現(xiàn)，Dnah1、Cfap43、Cfap44基因突變的病例占到其病例總數(shù)的28.2%，這也提示深入研究這三種基因的潛在功能對于更好地理解MMAF的發(fā)病有重要的作用。近年來MMAF受到了學者們的關注，近期又報道了MMAF的新致病基因Cfap69[5]以及最新報道的Cfap251[13-14]。這些研究均著眼于目的基因對精子鞭毛的影響，涉及對其他臟器的潛在威脅。本研究發(fā)現(xiàn)，Cfap43缺陷的小鼠其精子出現(xiàn)典型的MMAF表型，其睪丸病理提示生精功能存在異常，但是其他臟器的組織病理無顯著異常。有研究發(fā)現(xiàn)，Cfap43基因高表達于成年小鼠睪丸中[15]，其他組織相對較少或不表達，這或許可以解釋Cfap43缺陷導致的MMAF并不一定會伴隨著其他臟器的疾病。

CFAP43蛋白首次在牛精子中心粒被鑒定[16]，之后發(fā)現(xiàn)在人類精子也存在CFAP43蛋白[17]。CFAP蛋白是一類纖毛中高度保守的蛋白，其結構中富含WD重復結構域，而這種結構域在精子鞭毛內運輸(intraflagellar transport，IFT)蛋白中高度富集[18]，提示其在精子鞭毛形成過程中的重要作用[19]。IFT蛋白將位于胞質合成的重要蛋白運送到軸絲部位，參與動力蛋白臂的合成，其在精子鞭毛發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。CCDC39基因突變引起纖毛內側動力蛋白臂的缺失，文獻報道該基因與PCD有較大關聯(lián)[20]。據(jù)統(tǒng)計。PCD男性病例中，約有76%病例同時表現(xiàn)為弱精子癥[13]，而這部分患者中精子形態(tài)學表現(xiàn)為MMAF的比例并不清楚。

本研究中，我們僅對部分實質器官進行了形態(tài)學研究。除睪丸與附睪組織外，其他臟器組織并未發(fā)現(xiàn)有明顯的異常。CFAP43在肺組織中有一定的表達[15]，而肺的各級支氣管的表面分布著呈柱狀的纖毛組織，擺動的纖毛負責清除粘液與異物組織[7，21]。CFAP43作為一種結構蛋白，其在精子鞭毛形成中主要影響內側動力蛋白臂的正常結構形成[12]，但其是否影響其他運動纖毛(呼吸道、支氣管粘膜表面的運動纖毛)的正常結構與功能目前尚無研究。腎臟上皮細胞電鏡下存在著初級纖毛，與運動纖毛不同的是，初級纖毛主要起到維持細胞形態(tài)與組織完整的作用[22]，ADPKD的發(fā)生正是由于初級纖毛上的多囊蛋白(polycystin-1、2，PC-1、2)突變引起，CFAP43蛋白是否參與腎臟上皮細胞的初級纖毛結構組成，以及該蛋白突變后能否引起纖毛信號通路(cilia-dependent cyst activation，CDCA)的激活或抑制進而引起腎臟的囊性病理改變[8]，目前尚無充分研究解釋這些猜想。我們的實驗結果暫未發(fā)現(xiàn)Cfap43敲除小鼠腎臟組織病理表現(xiàn)為典型的多囊腎，后期需要更多的探索來解開這些疑問。

總結與展望：Cfap43缺陷導致精子尾部畸形，但是含纖毛的組織(肺、腎、腦)和不包含纖毛的組織(肝、脾)病理上未發(fā)現(xiàn)明顯影響。纖毛組織在不同的物種間具有高度的保守性，但在同一物種內，其在各器官內的分化機制卻不相同。CFAP43作為一種纖毛與鞭毛的結構蛋白，其在小鼠的各器官中表達含量不盡相同，當Cfap43缺陷時，各器官尤其是含有纖毛組織的器官病變也存在較大的差異。纖毛組織在生物體內除了起到運動功能外，其還參與細胞信號轉導的過程，而各組織細胞間存在著部分信號轉導的差異性，導致后期的生物學事件也不相同，這可能與上述器官病變的差異性有關。未來需要更多的研究去解釋這些現(xiàn)象。