蔣益群,李東,王珊珊,陳林君,史建彬,張寧媛
(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,南京 210008)
輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用提高了多胎妊娠率以及相關(guān)的孕產(chǎn)婦和新生兒并發(fā)癥發(fā)生率,包括高血壓、糖尿病、出血、貧血、絨毛膜羊膜炎、泌尿生殖系統(tǒng)感染、早產(chǎn)和低出生體重[1-2]。選擇性單胚胎移植可使多胎妊娠率最小化,而囊胚越過了胚胎基因組激活階段,可淘汰部分非整倍體胚胎,有助于胚胎挑選[3-4]?;诖?單囊胚移植技術(shù)已被大多數(shù)生殖中心廣泛應(yīng)用,通過選擇最具活力的胚胎來提高妊娠率,降低多胎率。
關(guān)于囊胚形態(tài)參數(shù)與妊娠結(jié)局的相關(guān)性,結(jié)論不一。有的研究認(rèn)為滋養(yǎng)層等級(jí)最能預(yù)測新鮮或凍融周期的單囊胚移植的妊娠成功[5-6],而另一些研究則認(rèn)為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)等級(jí)是成功胚胎植入和活產(chǎn)的有力預(yù)測因子[7-8],還有的研究建議評估囊胚腔的擴(kuò)張程度以預(yù)測妊娠結(jié)局[9-10]。本研究考慮到囊胚滋養(yǎng)層(TE)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的高度動(dòng)態(tài)性、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)準(zhǔn)確觀察的困難性以及它們之間存在相互影響、相互促進(jìn)的關(guān)系,我們設(shè)計(jì)了這項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究,評估在單囊胚凍融周期中囊胚整體質(zhì)量與妊娠結(jié)局以及新生兒結(jié)局之間的相關(guān)性。
回顧性分析2016~2017年在本中心進(jìn)行單囊胚凍融移植患者的臨床資料。
納入/排除標(biāo)準(zhǔn):新鮮周期促排方案為常規(guī)長方案患者;女方年齡≤38周歲;移植日子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm;體重指數(shù)(BMI)18~25 kg/m2;排除供精、供卵及PGD/PGS周期病例。
共納入984例患者。根據(jù)囊胚整體質(zhì)量分為3組:A組為高質(zhì)量囊胚(n=259),B組為中等質(zhì)量囊胚(n=400),C組為低質(zhì)量囊胚(n=325)。同時(shí)根據(jù)滋養(yǎng)層外是否存在碎片或卵裂球?qū)組患者進(jìn)一步分組:C1組為不存在碎片或卵裂球(n=197),C2組為存在碎片或卵裂球(n=128)。
常規(guī)促排卵及常規(guī)體外受精[11-12]后第3天,將移植冷凍后剩余胚胎轉(zhuǎn)至囊胚培養(yǎng)液 G2(Vitrolife,瑞典)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。第5、6天(D5、D6)觀察胚胎,按照Gardner評分體系[13]對囊胚進(jìn)行評分。本中心的冷凍標(biāo)準(zhǔn)為3BC和3CB及以上級(jí)別的囊胚。
本研究將高質(zhì)量囊胚定義為:(3~6)AA、AB、BA;中等質(zhì)量囊胚定義為:(3~6)BB、AC、CA;低質(zhì)量囊胚定義為(3~6)CB、BC。
對囊胚進(jìn)行激光皺縮,然后將囊胚放入平衡液(ES)中平衡10~15 min,轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液(VS)(KITAZATO,日本)中平衡30~60 s,轉(zhuǎn)移至冷凍載桿(Cryotop)上,然后浸入液氮。在移植當(dāng)天進(jìn)行囊胚復(fù)蘇,分四步,將待復(fù)蘇囊胚依次置于復(fù)蘇液(TS、DS、WS、WS)(KITAZATO,日本)中,將復(fù)蘇囊胚移入提前準(zhǔn)備好的囊胚培養(yǎng)液G2(Vitrolife,瑞典)中,放入37℃、6%CO2和5%O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。移植前評估胚胎的存活情況,囊胚腔重新擴(kuò)張判斷為囊胚存活。
采用人工周期或自然周期進(jìn)行子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備。自然周期:月經(jīng)規(guī)律,排卵正常者于月經(jīng)周期的第12天開始陰道B超監(jiān)測排卵,排卵日后第1天常規(guī)黃體支持,第5天胚胎移植;人工周期:排卵障礙者于月經(jīng)第2天開始服戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂,先靈,德國),2~3 mg,Bid,服用10 d后開始陰道B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜,當(dāng)內(nèi)膜厚度達(dá)到8 mm以上時(shí)開始常規(guī)黃體支持,黃體支持第6天胚胎移植。
移植后14 d檢測HCG指標(biāo),陽性者于移植后28 d行B超檢查,見孕囊者確診為臨床妊娠。不足28周終止妊娠者為流產(chǎn)。
A、B、C三組患者的女方年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度均無顯著性差異(P>0.05),而三組患者間囊胚冷凍時(shí)期比較有顯著性差異(P<0.05)(表1)。
組 別例數(shù)女方年齡不孕年限不孕類型原發(fā)不孕繼發(fā)不孕BMI(kg/m2)A組25930.97±3.963.47±2.50115(44.40)144(55.60)21.07±2.08B組40030.96±3.943.75±2.69200(50.00)200(50.00)21.00±2.22C組32531.11±3.953.43±2.50164(50.46)161(49.54)20.94±2.44組 別例數(shù)FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案囊胚冷凍時(shí)期人工周期自然周期D5D6移植日內(nèi)膜厚度(mm)A組259204(78.76)55(21.24)222(85.71)?37(14.29)?9.40±1.57B組400302(75.50)98(24.50)292(73.00)?108(27.00)?9.42±1.43C組325252(77.54)73(22.46)198(60.92)?127(39.08)?9.40±1.66
注:組間相互比較,*P<0.05
A、B、C三組患者間臨床妊娠率(70.66% vs.60.75% vs.44.31%,P<0.05)及活產(chǎn)率(61.39% vs.48.00% vs.34.46%,P<0.05)均有顯著差異;A、B、C三組患者的流產(chǎn)率逐漸增加,但無顯著性差異(13.11% vs.19.75% vs.22.92%,P>0.05);三組患者間新生兒出生體重?zé)o顯著差異(P>0.05)(表2)。
1.一般資料:C1、C2兩組患者間女方年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度以及囊胚冷凍時(shí)期均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。
組 別例數(shù)臨床妊娠率流產(chǎn)率活產(chǎn)率孕周新生兒體重(g)A組259183/259(70.66)?24/183(13.11)159/259(61.39)?38.21±1.653 426.73±578.80B組400243/400(60.75)?48/243(19.75)192/400(48.00)?38.02±1.643 361.80±481.65C組325144/325(44.31)?33/144(22.92)112/325(34.46)?38.45±1.633 395.98±456.61
注:組間相互比較,*P<0.05
2.臨床結(jié)局及新生兒結(jié)局比較:與C1組比較,C2組的臨床妊娠率(50.00% vs.40.61%,P<0.05)及活產(chǎn)率(39.84% vs.30.96%,P<0.05)均顯著升高(表4)。
注:與C1組比較,*P<0.05
在凍融單囊胚移植周期中,影響囊胚成功種植的因素有子宮內(nèi)膜、囊胚質(zhì)量以及患者心理因素等,其中囊胚質(zhì)量是胚胎實(shí)驗(yàn)室關(guān)注的最重要的指標(biāo)。我們的臨床資料中顯示,高質(zhì)量囊胚組D5比例顯著高于低質(zhì)量囊胚組。武龍梅等[14]的研究也得出相似結(jié)果,他們回顧性分析凍融囊胚移植患者的臨床資料,D5組與D6組相比,新鮮周期的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著增高。分析可能的原因:D6囊胚發(fā)育延遲,影響囊胚質(zhì)量;優(yōu)質(zhì)囊胚在D5已被優(yōu)先冷凍。
本研究結(jié)果顯示:隨著囊胚質(zhì)量的增加,臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著增加,流產(chǎn)率有降低趨勢,但無顯著性差異。Oron等[15]回顧性分析了凍融單囊胚移植周期1541例患者的臨床結(jié)局,結(jié)果顯示移植高質(zhì)量囊胚相比低質(zhì)量囊胚可獲得更高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率。柳亞楠等[16]的研究將231例高質(zhì)量囊胚與154例低質(zhì)量囊胚進(jìn)行比較,結(jié)果顯示臨床妊娠率(71.00% vs.42.86%)和活產(chǎn)率(54.55% vs.32.47%)均有顯著性差異,囊胚的質(zhì)量能顯著影響妊娠結(jié)局。在一項(xiàng)通過形態(tài)學(xué)預(yù)測整倍體囊胚妊娠結(jié)局的研究中,作者強(qiáng)調(diào)整倍體囊胚總體質(zhì)量、TE和ICM等級(jí)與患者妊娠結(jié)局正相關(guān)[17]。Irani等[18]的研究根據(jù)囊胚質(zhì)量將701例囊胚分為好、中、差三組,其活產(chǎn)率和種植率有顯著性差異。Minasi等[19]還研究了1 730個(gè)囊胚的倍性狀態(tài)與形態(tài)學(xué)和形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間的潛在相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)整倍體胚胎開始分裂、擴(kuò)張和孵化的時(shí)間較短,而且高質(zhì)量TE和ICM的比例較高,發(fā)育級(jí)別較高。
關(guān)于新生兒出生結(jié)局,我們的研究結(jié)果顯示:孕周和新生兒出生體重與移植的囊胚質(zhì)量無顯著關(guān)聯(lián)。孟慶霞等[20]的研究也表明內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層質(zhì)量并不能預(yù)測新生兒出生體重。王雪等[21]的研究顯示,在單胎組中,D5和D6囊胚凍融移植后出生的新生兒孕周、出生體重和體長均無顯著性差異,同時(shí)在雙胎組中也得出相似的結(jié)果。也有研究指出,出生體重與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量相關(guān),因?yàn)閮?nèi)細(xì)胞團(tuán)最終會(huì)發(fā)育成胎兒[22]。然而,出生體重的影響因素很多,包括新生兒性別、父母體重、孕婦的健康狀況以及孕期營養(yǎng)等。本研究中新生兒結(jié)局的樣本量相對較少,后續(xù)還需進(jìn)一步排除混雜因素,做更深入研究。另有研究表明囊胚期胚胎相比于分裂期胚胎性別比有顯著性差異[23-24],可能由于男女胚胎染色體的差異,男性胚胎較女性胚胎具有更好的發(fā)育潛能[25-26]。因此,探討囊胚質(zhì)量與新生兒性別的關(guān)系,也需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。
在臨床工作中,我們發(fā)現(xiàn)形成的低質(zhì)量囊胚,在滋養(yǎng)層外經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)排出的碎片或卵裂球,胚胎碎片有可能是促排卵或體外操作導(dǎo)致卵裂球損傷產(chǎn)生的,也有可能是胚胎修復(fù)機(jī)制,排出了染色體異常的卵裂球,或以碎片形式排出部分異常細(xì)胞[27-28]。我們的結(jié)果也顯示,對于存在碎片或卵裂球的囊胚,其臨床妊娠率及活產(chǎn)率不但沒有受到影響,反而有顯著性增加。有理由推斷,本研究中低質(zhì)量組的C2亞組囊胚由于排出了染色體異常的細(xì)胞,相比于C1亞組可能有更高的整倍性。因此,我們推斷當(dāng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層質(zhì)量達(dá)到一定等級(jí)時(shí),滋養(yǎng)層外碎片及卵裂球不應(yīng)作為一項(xiàng)負(fù)性指標(biāo)。需要在以后的研究中對這一類型囊胚進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(PGT-A),進(jìn)一步驗(yàn)證這一推斷。
綜上所述,本研究表明,在凍融單囊胚移植周期中,囊胚總體質(zhì)量可預(yù)測患者臨床妊娠率、活產(chǎn)率;同時(shí),對于低質(zhì)量囊胚,滋養(yǎng)層外碎片或卵裂球不應(yīng)作為臨床妊娠率和活產(chǎn)率的負(fù)性指標(biāo)。本研究沒有細(xì)分D5與D6囊胚,也沒有對TE和ICM形態(tài)進(jìn)行區(qū)分比較,而且這是一項(xiàng)回顧性研究,因此,在以后的研究中需要有更大的隊(duì)列進(jìn)行前瞻性研究來綜合考量目前的結(jié)論。