長(zhǎng)鏈非編碼RNA 在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者和健康人PBMCs 中的差異表達(dá)及其發(fā)病機(jī)制研究

唐薦 魏小華

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎為臨床常見的骨性關(guān)節(jié)炎疾病， 主要患病人群為中老年人， 主要癥狀表現(xiàn)為活動(dòng)限制、關(guān)節(jié)畸形以及疼痛等， 長(zhǎng)時(shí)間臥床患者會(huì)出現(xiàn)肌肉萎縮［1，2］。lncRNA屬于RNA 分子， 其長(zhǎng)度＞200 bp， 但并未對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。目前臨床研究證實(shí)lncRNA 可對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響， 和膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制存在關(guān)系［3，4］。本次研究主要探討lncRNA 在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者和健康人PBMCs中的差異表達(dá)及其發(fā)病機(jī)制， 現(xiàn)將研究過程具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料

選取2016 年12 月～2018 年12 月本院收治的40 例膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者作為觀察組, 其中男24 例,女16 例, 年齡36～52 歲, 平均年齡(42.2±3.5)歲。另選取同期40 例健康體檢者作為對(duì)照組, 其中男26 例, 女14 例；年齡34～55 歲, 平均年齡(43.5±3.9)歲。兩組研究對(duì)象的性別及年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。

1. 2 方法

1. 2. 1 細(xì)胞采集

抽取膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者和健康人外周靜脈血, 采血量為5 ml, 將其放置在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中, 對(duì)其進(jìn)行離心后將血漿放置在1.5 ml 離心管(EP 管), 在-80℃冰箱中凍存；血細(xì)胞層經(jīng)過離心后對(duì)淋巴細(xì)胞分離液PBMCs 予以適應(yīng), 完成離心后采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS) 0.1 mol/L 對(duì)PBMCs 細(xì)胞進(jìn)行洗滌, 在-80℃冰箱中凍存［5,6］。總RNA 提?。嚎俁NA 提取方法為Trizol, 首先選擇相關(guān)提取試劑, 即mir Vana RNA 對(duì)患者以及健康人PBMCs 內(nèi)的總RNA 進(jìn)行提取, 對(duì)其進(jìn)行純化后選擇相關(guān)設(shè)備分析總RNA 的質(zhì)量以及定量。

1. 2. 2 lncRNA 分析表達(dá)

依據(jù)反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸(cDNA)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)患者以及健康人總RNA 實(shí)施合成, 從而形成cRNA。需要標(biāo)記cRNA, 采用Agilent Human lncRNA Microarray 芯片對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行雜交, 而后采用相關(guān)數(shù)據(jù)分析, 觀察組lncRNA 變化和對(duì)照組相比＞2 倍說明具有差異表達(dá)［7,8］。生物學(xué)途徑對(duì)差異表達(dá)的mRNA 功能屬性進(jìn)行分析, 創(chuàng)建其網(wǎng)絡(luò)表達(dá)。和疾病相關(guān)的lncRNA 均選自Cis-以及Trans-進(jìn)行分析。

1. 2. 3 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)差異表達(dá)lncRNA 進(jìn)行選取, 驗(yàn)證對(duì)象為差異倍數(shù)較大的lncRNA, 內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH), 對(duì)其實(shí)施PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃, 變形95℃, 退火58℃, 延伸72℃, 然后對(duì)患者和健康人的基因表達(dá)變化倍數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2. 1 mRNA 和lncRNA 差異 表達(dá)

Agilent Human lncRNA Microarray 芯片對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行雜交后, 通過相關(guān)軟件檢測(cè)有效數(shù)據(jù)可知, 觀察組患者和對(duì)照組PBMCs 中的差異表達(dá)為1615 條, mRNA 差異表達(dá)數(shù)量大致為840 條, 同時(shí)倍數(shù)在2 以上。1105 條lncRNA 表達(dá)上調(diào), 510 條lncRNA 表達(dá)下調(diào)。

2. 2 Go 以 及Pathway 相 關(guān) 分 析

對(duì)差異表達(dá)進(jìn)行GO 分析后可知, mRNA 差異表達(dá)功能包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白激酶以及金屬離子等。Pathway 分析認(rèn)為其功能和B 細(xì)胞受損以及TNF 信號(hào)存在關(guān)系。創(chuàng)建其網(wǎng)絡(luò)表達(dá)后, 獲取216 對(duì)lncRNA-mRNA。通過Cis-及Trans-分析后可能和疾病存在關(guān)系的lncRNA 包含NONHSAT027875、FR378506 和NONHSAT031501。

2. 3 PCR 驗(yàn)證

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)針對(duì)差異表達(dá)倍數(shù)較大的部分lncRNA 和與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)的lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證, 結(jié)果顯示, MONHSTAT120696、uc.80+和NONHSAT031501 在擴(kuò)大樣本中得到較好的驗(yàn)證, 與芯片雜交的結(jié)果相仿。經(jīng)PCR 驗(yàn)證, 與疾病存在關(guān)系的lncRNA 包括MONHSTAT120696、uc.80+和NONHSAT031501。見表1。

表1 PCR 驗(yàn)證試驗(yàn)與芯片雜交實(shí)驗(yàn)倍數(shù)變化比較

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是因?yàn)橄リP(guān)節(jié)軟骨變性和骨質(zhì)增生產(chǎn)生的慢性骨關(guān)節(jié)疾病， 在臨床中又稱為膝關(guān)節(jié)增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎。疾病產(chǎn)生原因?yàn)殛P(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)磨損， 關(guān)節(jié)間隙逐漸變窄以及軟骨下骨質(zhì)硬化。本病主要在于預(yù)防， 并且需要適當(dāng)進(jìn)行體育鍛煉， 以免關(guān)節(jié)出現(xiàn)超負(fù)荷使用， 對(duì)畸形或其他致病因素進(jìn)行及時(shí)矯正。

目前， 臨床對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子、微小RNA(miRNA)和信號(hào)通路向軟骨分化和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中起到作用研究較多， 對(duì)于lncRNA 的作用逐漸予以重視。lncRNA 屬于一種非編碼RNA， 依據(jù)基因和臨近蛋白位置可將其劃分為5 類。lncRNA 未參與蛋白質(zhì)合成， 但是能夠?qū)Φ鞍缀铣善鸬秸{(diào)控作用， 即調(diào)控轉(zhuǎn)錄、核內(nèi)運(yùn)動(dòng)以及轉(zhuǎn)錄后加工影響。lncRNA效果具有多樣性特征， 在基因表達(dá)中意義重大， 表達(dá)異常會(huì)引發(fā)相關(guān)疾病。大部分臨床研究表明lncRNA 和心血管疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病均存在關(guān)系。

本次研究分析膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者和健康人PBMCs中差異表達(dá)， 以探究膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制， 進(jìn)而為臨床治療提供可靠數(shù)據(jù)。在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程中，lncRNA 表觀遺傳變化對(duì)于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展具有重要意義， lncRNA 能夠經(jīng)過乙酰化修飾組織蛋白， 對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性起到調(diào)節(jié)作用。為此lncRNA 表觀遺傳能力可制作出相關(guān)治療藥物。伴隨基因時(shí)代的到來， 基因芯片雜交技術(shù)以及相關(guān)檢測(cè)均已完善， 可更加深入lncRNA 的臨床研究。

綜上所述， 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者中l(wèi)ncRNA PBMCs 具有差異表達(dá)， 同時(shí)可對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行調(diào)控， 致使PBMCs 出現(xiàn)紊亂。然而還需要繼續(xù)深入探究膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病機(jī)制， 為早期診斷以及治療提供依據(jù)。