芪明顆粒防治早期放射性視網(wǎng)膜病變的機制研究

劉愛琴 ，王倩 ，阮琳潔 ，董國軍 ，嚴(yán)然

放射性治療是腫瘤常見治療方式之一，尤其是頭頸部腫瘤，約有65%～75%的惡性腫瘤患者治療方案中包含放射性治療[1]。持續(xù)的低劑量或超過閾值的劑量會損傷眼部的葡萄膜血管、視網(wǎng)膜，形成放射性視網(wǎng)膜病變（Radioactive Retinopathy，RR），即慢性進行性、遲發(fā)性視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和視盤的血管閉塞性疾病[2]，臨床表現(xiàn)以患者的視功能下降為主，對腫瘤患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，是放療后常見致盲的原因之一。目前對視網(wǎng)膜病變的干預(yù)，西醫(yī)治療主要以玻璃體腔注藥[3]、視網(wǎng)膜激光光凝[4]、光動力療法[5]、皮質(zhì)類固醇[6]、抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[7]治療等，多適用于中后期癥狀表現(xiàn)明顯的患者。中醫(yī)認(rèn)為此病屬于“視瞻昏渺”“暴盲”等范疇，治療以益氣化瘀通絡(luò)、補益肝腎為原則，達通絡(luò)明目之效[8]。鄧永紅等[9]研究證實芪明顆粒能夠早期及時干預(yù)放射性視網(wǎng)膜損傷，導(dǎo)致視網(wǎng)膜的血管微循環(huán)好轉(zhuǎn)，促進視網(wǎng)膜出血、滲出的重吸收，從而明顯的改善視功能。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與RR的新生血管生成存在一定的關(guān)系，并調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)進一步作用VEGF的表達。因此，本實驗通過觀察芪明顆粒對早期RR大鼠模型用藥過程中病變視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)改變，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白 (C/EBP-homologous protein，CHOP)的表達，以及HIF-1α、VEGF表達情況，從而明確芪明顆粒干預(yù)RR的療效，并對其機制進行研究，為臨床治療放射性視網(wǎng)膜病變提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

2月齡清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠75只，平均體重約200 g。飼養(yǎng)環(huán)境：空氣流通，室溫18～26℃，相對濕度 55%～70%，12 h晝夜交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為正常組、模型組、中藥組，共3組，各25只。

1.2 儀器與試劑

用于放射造模的 Elekta Com Pact(TM)治療器(瑞典醫(yī)科達公司生產(chǎn))；眼科手術(shù)顯微鏡（蘇州六六公司）；視網(wǎng)膜組織切片觀察分析用顯微鏡（Olympus,Tokyo,Japan,BX53）。正常組與模型組選用0.9%氯化鈉注射液；中藥組選用芪明顆粒（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，批號：980908）。

1.3 模型制作

將大鼠按體重決定麻醉劑量，照射前模型組和中藥組均按照7%的水合氯醛5 ml/kg麻醉。麻醉方法：用左手固定住大鼠頸部，小拇指緊扣尾部，對腹部進行常規(guī)消毒，右手于右下腹部進針，向上約45°，刺入腹腔為止，等大鼠無翻正反射后，使其俯臥在放射臺上，用透明膠布固定，暴露頭上部。將放射區(qū)域調(diào)整在2 cm×2 cm范圍，將光野上界調(diào)在雙眼內(nèi)眥的連線上，下界調(diào)在雙耳后的連線上，進行放射對位，利用鉛塊將放射野外的軀干部位進行遮蔽，使得口腔和鼻腔排外放射。將放射調(diào)整為SSD模式，距離100 cm，深度及等效為2 cm，吸收率80 cGy/min，照射量10 Gy/次，每次持續(xù)照射約13 min，1周進行1次照射，共3次，總劑量為30 Gy。待照射完畢后，大鼠蘇醒便立即送回到眼科實驗室，照射組分組后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 用藥方法

各組大鼠在造模后3個月開始給藥，連續(xù)灌胃1個月。具體給藥步驟及方法如下。

正常組：灌胃劑量與中藥劑量組大鼠等容量的生理鹽水，每日1次。

模型組：灌胃劑量與中藥劑量組大鼠等容量的生理鹽水，每日1次。

中藥組：將芪明顆粒加入生理鹽水?dāng)嚢杈鶆?，配成芪明顆粒水溶液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)成人（以60 kg體重計算）的口服劑量，芪明顆粒（4.5 g，每日3次）服用劑量13.5 g/日，合算為0.225 g/kg的日用量。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)觀察 分別于用藥1個月、3個月后取其右眼行HE染色，制備視網(wǎng)膜消化鋪片，在不同的倍數(shù)下觀察視網(wǎng)膜血管走行、分布，以及周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)特點。

1.5.2 大鼠視網(wǎng)膜CHOP、HIF-1α、VEGF表達檢測分別于用藥1個月、3個月后取各組大鼠左眼進行免疫組化染色，統(tǒng)計CHOP、HIF-1α、VEGF的表達情況。具體免疫組化染色方法：（1）取石蠟切片于烤片機烘烤 2～3 h，放置 60℃烤箱 18 h；（2）用吹風(fēng)機吹至產(chǎn)生蠟液，采用二甲苯脫蠟20 min，并在無水酒精與蒸餾水配置的梯度乙醇中脫水；（3）將配置好的枸櫞酸緩沖液于高壓鍋中煮沸后，將切片置入，高壓煮沸加熱2～3 min，取出切片自然冷卻至室溫；（4）切片放置3%過氧化氫罐中10 min，取出用自來水沖洗多次，最后一次用PBS沖洗；（5）50 ul山羊血清封閉 10 min，滴加一抗（1：40），放置 4℃冰箱14 h；（6）PBS 沖洗 3 次，每次約 3～5 min；擦拭組織周圍水分，加入Envision二抗，放置37℃孵箱中25 min；（7）PBS 沖洗 3 次，每次約 3～5 min；滴加 DAB顯色劑，顯色后反復(fù)自來水清洗；（8）切片置入蘇木精罐復(fù)染5 min，反復(fù)自來水清洗；（9）置入1%鹽酸酒精數(shù)秒后，用涼清水沖洗；置入氨水罐數(shù)秒后，用自來水沖洗；（10）取梯度乙醇對切片脫水，利用二甲苯透明，用樹脂封好組織切片。

圖1 各組早期RR視網(wǎng)膜細(xì)胞組織形態(tài)（HE ×200）。 1A 用藥1個月后正常組；1B 用藥1個月后模型組；1C 用藥 1個月后中藥組；1D 用藥3個月后正常組；1E 用藥3個月后模型組；1F 用藥 3個月后中藥組

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進行分析，對比分析視網(wǎng)膜各層細(xì)胞、組織變化。多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析方法，兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD）。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪明顆粒作用于早期RR視網(wǎng)膜細(xì)胞組織形態(tài)

用藥1個月后，模型組視網(wǎng)膜顯著變薄，主要為外核層、內(nèi)核層，節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞組織排列紊亂水腫，無色素層細(xì)胞，余各層細(xì)胞排列稀疏。與模型組相比較，中藥組節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞組織更整齊致密，外核層、內(nèi)核層層數(shù)及形態(tài)比較完整，水腫減輕，無明顯水腫及空泡（圖 1A-1C）。

用藥3個月后，模型組視網(wǎng)膜內(nèi)界膜、視神經(jīng)纖維層的毛細(xì)血管增生，擴張，纖維不同程度增生。與模型組比，中藥組節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞組織顯著整齊，外核層、內(nèi)核層形態(tài)比較完整（圖1D-1F）。

2.2 芪明顆粒影響早期RR視網(wǎng)膜CHOP蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF表達的影響

CHOP蛋白表達：用藥1個月、3個月后，與正常組相比，模型組、中藥組表達均增多。與模型組比較，中藥組表達均減少，1個月后兩組含量比較（t=2.563，P=0.028），3 個月后 2 組含量比較 （t=9.513，P=0.000）均具有統(tǒng)計學(xué)意義。（表1、圖2A-2F）

HIF-1α蛋白表達：用藥1、3個月后，與正常組相比，模型組、中藥組表達均增多。與模型組比較，中藥組表達均減少，1個月后2組含量比較 （t=7.873，P=0.000），3 個月后 2 組含量比較（t=7.412，P=0.000）均具有統(tǒng)計學(xué)意義。（表1、圖3A-3F）

VEGF蛋白表達：用藥1、3個月后，與正常組相比，模型組、中藥組表達均增多。與模型組比較，中藥組表達均減少，1個月后兩組含量比較 （t=4.072，P=0.002），3 個月后兩組含量比較 （t=11.986，P=0.000）均具有統(tǒng)計學(xué)意義。（表1、圖4A-4F）

表1 各組早期RR視網(wǎng)膜CHOP蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF平均光密度值比較（xˉ±s，n=6）

圖2 各組視網(wǎng)膜CHOP免疫組化染色（×200）。 2A用藥1個月后正常組；2B用藥1個月后模型組；2C用藥1個月后中藥組，中藥組CHOP陽性表達低于模型組；2D 用藥3個月后正常組；2E 用藥3個月后模型組；2F 用藥3個月后中藥組，中藥組CHOP陽性表達低于模型組，與正常組相近。CHOP蛋白存在以節(jié)細(xì)胞胞漿為主的視網(wǎng)膜各層細(xì)胞胞漿中，陽性胞漿呈棕黃色、黃色。CHOP：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白

圖3 各組視網(wǎng)膜HIF-1α免疫組化染色（×200）。 3A用藥1個月后正常組；3B用藥1個月后模型組；3C用藥1個月后中藥組，中藥組較模型組HIF-1α陽性表達低，與正常組相近；3D用藥3個月后正常組；3E用藥3個月后模型組；3F用藥3個月后中藥組，中藥組較模型組HIF-1α陽性表達明顯低，與正常組更近。HIF-1α蛋白存在以節(jié)細(xì)胞胞漿為主的視網(wǎng)膜各層細(xì)胞胞漿中，陽性胞漿呈棕黃色、黃色。 HIF-1α：低氧誘導(dǎo)因子-1α

圖4 各組視網(wǎng)膜VEGF免疫組化染色（×200）。4A 用藥1個月后正常組；4B 用藥1個月后模型組；4C 用藥1個月后中藥組，中藥組較模型組VEGF陽性表達低，與正常組相近；4D 用藥3個月后正常組；4E 用藥3個月后模型組；4F 用藥3個月后中藥組，中藥組較模型組VEGF陽性表達明顯低，與正常組更近。VEGF蛋白存在以節(jié)細(xì)胞胞漿為主的視網(wǎng)膜各層細(xì)胞胞漿中，陽性胞漿呈棕黃色、黃色。VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

3 討論

超閾值劑量或持續(xù)低劑量的放射線照射對眼部造成的視力影響，主要由于眼底毛細(xì)血管的周細(xì)胞的損傷、內(nèi)皮細(xì)胞的受損、喪失，毛細(xì)血管管壁變性增厚導(dǎo)致血管狹窄阻塞，微循環(huán)障礙，從而引發(fā)視網(wǎng)膜缺血、缺氧，激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，誘導(dǎo)氧化反應(yīng)，調(diào)控下游CHOP蛋白高表達，進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。VEGF是缺血、缺氧的條件下視網(wǎng)膜新生血管生成的關(guān)鍵因子，可迅速提高微血管的通透性，促進血漿蛋白大量分泌，導(dǎo)致血管滲漏；同時促進內(nèi)皮細(xì)胞在有絲分裂過程中死亡，難以補償丟失的細(xì)胞，誘發(fā)新的血管腔形成，造成血-視網(wǎng)膜屏障，繼而血管內(nèi)液體外漏，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫或淺脫離，長期的水腫最終出現(xiàn)神經(jīng)元變性壞死、視功能下降[11]。HIF-1α作為低氧誘導(dǎo)因子，在缺氧條件下可穩(wěn)定VEGF的活性，加速新生血管的發(fā)生發(fā)展[12-13]。目前對于早期放射性視網(wǎng)膜病變的干預(yù)，西醫(yī)治療并無明確優(yōu)勢。

芪明顆粒因其具有多靶點直接促進癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管增生等作用，在腫瘤輔助治療領(lǐng)域具有巨大潛力[14]。現(xiàn)代研究證明黃芪可通過清除活性氧，進而保護視網(wǎng)膜細(xì)胞組織的作用；枸杞多糖的抗氧化作用可對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞起保護作用[15]，決明子可提高乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的含量，以產(chǎn)生豐富的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）為機體功能，擴張末梢血管，改善視神經(jīng)的血液循環(huán)[16]，水蛭可降低HIF-1α介導(dǎo)的VEGF mRNA表達，抑制新生血管的生成，改善微環(huán)境缺血、缺氧狀態(tài)，從而達到抗腫瘤的作用[17]。此外，中醫(yī)認(rèn)為放射線屬火熱毒邪，直中目系，灼傷目中陰血、津液，則目絡(luò)失養(yǎng)，故RR早期病機特點可概括為火熱傷津，氣陰兩虛，當(dāng)以益氣養(yǎng)陰通絡(luò)為要，且目為肝竅，瞳神屬腎，肝腎精血虧損則無以滋養(yǎng)目竅，故芪明顆粒益氣生津，滋養(yǎng)肝腎，通絡(luò)明目之功效符合早期RR的治法。本實驗發(fā)現(xiàn)用藥1個月、3個月后，視網(wǎng)膜組織細(xì)胞水腫顯著減輕，細(xì)胞形態(tài)、排列均有所改善，隨著用藥時間延長，CHOP、HIF-1α、VEGF等表達逐漸下降向正?？拷Ｒ虼宋覀冏C實芪明顆?？赏ㄟ^抑制CHOP蛋白的表達，干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，緩解視網(wǎng)膜水腫，恢復(fù)視網(wǎng)膜細(xì)胞組織形態(tài)，同時調(diào)控HIF-1α降低VEGF，抑制了新生血管的生成及發(fā)展，最終改善早期放射性視網(wǎng)膜病變。而放射性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制較為復(fù)雜，本實驗只證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)引起新生血管生成可能是其發(fā)病機制之一，因此芪明顆粒干預(yù)早期放射性視網(wǎng)膜病變機制還有待進一步研究。