miR-424在胃癌組織中的表達及其臨床意義

靳楓 余少康 王樹濱

【摘要】 目的：檢測胃癌組織中miR-424的表達，并探討其與胃癌臨床病理特征及預后的關系。方法：選取本院收治的55例胃癌患者的胃癌組織樣本及相應癌旁組織，應用RT-PCR法檢測胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA表達，分析其與胃癌臨床病理特征間的關系。結(jié)果：4例患者隨訪失敗，研究實際完成51例;胃癌組織中miR-424 mRNA陽性檢出率為66.67%，明顯高于癌旁組織的23.53%（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達高于癌旁組織（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無關（P>0.05），與浸潤深度、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關（P<0.01）;1年期隨訪發(fā)現(xiàn)，死亡15例，存活36例;死亡組在入院時胃癌組織中miR-424 mRNA表達高于存活組（P<0.01）。結(jié)論：miR-424 mRNA在胃癌組織中高表達，與胃癌的臨床病理特征密切相關，可能是評判胃癌患者預后的有效指標。

【關鍵詞】 miR-424; 胃癌; 臨床病理特征

【Abstract】 Objective：To observe miR-424 expression of gastric cancer tissue，and investigate the relationship between miR-424 and clinicopathological parameters of gastric cancer and prognosis.Method：A total of gastric cancer tissue samples and corresponding adjacent tissues from 55 patients with gastric cancer in our hospital were selected.The expression of miR-424 in gastric cancer tissues and adjacent tissues was detected by RT-PCR，and the relationship between miR-424 and clinicopathological features of gastric cancer was analyzed.Result：4 patients failed in follow-up，and 51 patients actually completed the study.The positive rate of miR-424 in gastric cancer tissues was 66.67%，which was significantly higher than 23.53% in adjacent tissues（P<0.01）.The expression of miR-424 in gastric cancer tissues was higher than that of adjacent tissues（P<0.01）.The expression of miR-424 in gastric cancer tissues was not related to age，sex，location of tumors and diameter of tumors（P>0.05），but to depth of invasion，TNM stage，differentiation degree and lymph node metastasis（P<0.01）.One-year follow-up showed that 15 patients died and 36 survived，and the expression of miR-424 in gastric cancer tissues of the death group was higher than that of the survival group at admission（P<0.01）.Conclusion：Expression of miR-424 mRNA of gastric cancer tissues is high，closely related to clinicopathological parameters of gastric cancer，and may be the effective index for evaluating the prognosis.

【Key words】 miR-424; Gastric cancer; Clinicopathological features

First-authors address：Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.032

胃癌是一種最常見惡性腫瘤，患者的預后差，其致死率位居整個惡性腫瘤的第3位，對人類的健康、生存構(gòu)成了嚴重威脅[1]。據(jù)報道早期胃癌的5年期生存率超過90%，但在進展期胃癌的5年生存率僅有5%～20%[2]，臨床資料顯示絕大多數(shù)胃癌患者在確診時已屬中晚期，失去了手術的時機，同時存在放化療效的效果欠佳及不良反應重等[3]。消化道造影、胃鏡是診斷胃癌的金標準，但有操作較為復雜、患者耐受差以及價格昂貴等缺點[3]。腫瘤標志物是早期確診胃癌的有效指標，有操作便捷、創(chuàng)傷小、結(jié)果及時可靠等優(yōu)點，但目前胃癌腫瘤標志物特異性及敏感性較差[4]。miR-424是miR-16家族成員，其基因位于染色體Xq26.3上，Xq26區(qū)域與多種腫瘤的形成、發(fā)展密切相關。研究表明，miR-424在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預后中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而且在非小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎癌等多種腫瘤中均有表達。然而miR-424在胃癌組織中表達的相關研究目前國內(nèi)外尚鮮見報道。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法，檢測miR-424 mRNA在胃癌組織中的表達情況，并探討其和胃癌臨床病理學參數(shù)及患者預后的關系?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月-2017年2月本院收治的55例胃癌患者的胃癌組織樣本，均經(jīng)病理證實為胃癌，術前均未接受放療、化療等輔助治療，且有完整臨床病理資料;同時取對應癌旁組織（距癌組織邊緣≥5 cm）為對照組，均經(jīng)病理證實為正常胃組織。本研究得到本醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與設備 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購由美國Sigma公司提供;TRIzol試劑購由碧云天生物技術研究所提供;miR-424、β-Actin引物購于上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 RT-PCR檢測胃癌及癌旁組織中miR-424 mRNA表達 具體檢測方法：將冷凍的胃癌組織及癌旁周圍正常組織勻漿，Trizol法提取胃癌及癌旁組織中總RNA，向RNA沉淀中加入焦炭酸二乙酯，靜置于冰上30 min，置于-80 ℃保存;測定樣品中RNA的純度、濃度，取適量RNA反應物行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄程序：30 ℃反應10 min，42～60 ℃反應30 min，85℃和5 ℃分別反應5 min），采取SYBP Green premix Ex taq試劑盒檢測胃癌和癌旁組織中miR-424 mRNA表達;PCR引物為miR-424上游引物：5-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactgg-3，下游引物：5-cgaacgagcagcaattcatg-3;β-Actin為內(nèi)參照，上游引物：5-gcgagaagatgacccaccacc-3，下游引物：5-atgtcacgcacgatttcctatta-3;PCR反應體系：95 ℃預變性5 min，再行38個循環(huán)（94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸反應5 min。每個組織標本重復擴增3次，PCR電泳結(jié)果采用凝膠圖像掃描系統(tǒng)檢測各電泳條帶的吸光度值，計算miR-424 mRNA產(chǎn)物量與內(nèi)參β-actin mRNA產(chǎn)物量比值即為本研究結(jié)果。

1.3 觀察指標 （1）比較胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA陽性率。（2）比較胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA表達。（3）分析胃癌組織中miR-424 mRNA表達與患者的臨床病理特征的關系。（4）對患者進行1年期隨訪，記錄死亡病例，比較存活患者（存在組）和死亡患者（死亡組）入院時胃癌組織中miR-424 mRNA表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌病例篩選情況 4例患者隨訪失敗，研究實際完成51例，其中男34例，女17例;年齡52～70歲，平均（65.03±7.40）歲，≥60歲者30例，<60歲者21例;分化程度：低分化33例，中分化11例，高分化7例;部位：賁門5例，胃體18例，幽門28例;原發(fā)腫瘤最大直徑：≤5 cm者19例，>5 cm者32例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期28例;腫瘤浸潤深度：未侵及漿膜者26例，侵及漿膜者25例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。

2.2 胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA檢出情況 胃癌組織中miR-424 mRNA陽性檢出率為66.67%（34/51），明顯高于癌旁組織的23.53%（12/51），差異有統(tǒng)計學意義（字2=17.462，P<0.01）。

2.3 胃癌組織和癌旁組織中miR-424 mRNA表達比較 胃癌組織中miR-424 mRNA的表達為（0.721±0.079），高于癌旁組織的（0.311±0.034），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.260，P<0.01）。

2.4 胃癌組織中miR-424 mRNA表達與胃癌病理特征的關系 胃癌組織中miR-424 mRNA的表達與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無關（P>0.05），與浸潤深度、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關（P<0.01），見表1。

2.5 死亡組和存活組miR-424 mRNA表達比較 1年期隨訪發(fā)現(xiàn)，死亡15例，存活36例;死亡組在入院時胃癌組織中miR-424 mRNA表達為（0.833±0.103），高于存活組的（0.609±0.07），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.170，P<0.01）。

3 討論

我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和死亡率均高居整個惡性腫瘤的前列。目前對胃癌形成、發(fā)展的認知不斷深入，如大量腫瘤標志物的檢測有助于臨床診斷胃癌，但現(xiàn)有胃癌標志物的敏感性和特異性較差，探索新的胃癌標志物仍是提高胃癌確診的重要醫(yī)學問題[4-6]。胃癌的發(fā)生機制尚未闡明，癌基因和抑癌基因的改變是其重要調(diào)控機制，機體內(nèi)這些基因的改變對胃癌的生物學行為及其預后有重要影響[7-8]。miR-16家族主要包括miR-15a/b、miR-16、miR-195、miR-424等成員，參與細胞存活、增殖及凋亡等過程，其中miR-424基因位于染色體Xq26.3，具體位置為10：133680644-133680741，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療預后聯(lián)系密切[9]。文獻[10]報道m(xù)iR-424與一些惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關，且對不同腫瘤其侵襲轉(zhuǎn)移的作用有所差異，即促進或抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。

miR-424在不同癌細胞中的作用機制不盡相同。在宮頸癌細胞中，miR-424的低表達可降低基質(zhì)金屬蛋白酶9活性，從而抑制細胞侵襲轉(zhuǎn)移[11-12];同時宮頸癌中miR-424低表達，也可促進靶基因細胞周期檢測點激酶1的表達，引起細胞周期G1/S受阻，關閉細胞分裂周期，導致細胞增殖停滯[11-12]。SOCS6有負性調(diào)控細胞因子信號通路效應，抑制miR-424表達可上調(diào)靶基因SOCS6表達，同時抑制下游ERK信號通路，促進胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[13]。在結(jié)腸癌中，miR-424可激活mTORC2信號通路，該信號通路具有調(diào)控細胞生長的作用，促進腫瘤細胞生長[14]。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與血管新生密切相關，當原位瘤體積超過1 mm3，需刺激血管生成及通過血管通道代謝途徑，以促進腫瘤生長[5]。研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌患者中miR-424的表達異常，且與組織血管的增生明顯相關，miR-424過表達通過促進血管增生，從而促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[15]。提示miR-424可能是胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的有效分子標志。

本研究應用RT-PCR檢測顯示，胃癌組織中miR-424 mRNA陽性檢出率為66.67%，明顯高于癌旁組織的23.53%（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達高于癌旁組織（P<0.01）;胃癌組織中miR-424 mRNA的表達與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無關（P>0.05），與浸潤深度、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關（P<0.01）;1年期隨訪發(fā)現(xiàn)，死亡15例，存活36例;死亡組在入院時胃癌組織中miR-424 mRNA表達高于存活組（P<0.01）。上述結(jié)果從基因轉(zhuǎn)錄水平說明了miR-424表達可能是臨床評價胃癌臨床病理特征及患者治療預后的有效指標。

綜上所述，miR-424 mRNA在胃癌組織中高表達，與胃癌的分化程度等臨床病理特征密切相關，進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-424的過度表達與患者的預后相關，因此，檢測胃癌組織中miR-424 mRNA的表達有助于胃癌的診斷及預后判斷，但目前miR-424對胃癌的作用機制研究較少，利用miR-424將為臨床胃癌發(fā)生發(fā)展的確診、預后評判以及藥物篩選提供新策略。

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（收稿日期：2018-07-26） （本文編輯：董悅）