替莫唑胺聯(lián)合氟桂利嗪對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外作用機(jī)制

盧家潮　壽記新　李龍龍　王冰冰

【摘要】 目的：探討替莫唑胺（TMZ）聯(lián)合氟桂利嗪（FZ）對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外清除作用及可能機(jī)制。方法：用伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)膠質(zhì)瘤U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞株，用CCK-8試劑檢測(cè)并評(píng)價(jià)TMZ、FZ兩者單藥及聯(lián)合用藥處理后的U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞增殖抑制率及觀察TMZ的半數(shù)抑制濃度（IC50）;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：FZ單獨(dú)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后能起到一定的抑制作用，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)起不到治療效果;在同類細(xì)胞中，TMZ單藥作用細(xì)胞株后IC50分別為（562.3±56.7）、（370.5±40.2）、（480.9±29.6）、（420.5±61.4）μg/mL。在不同濃度的FZ聯(lián)合TMZ應(yīng)用后TMZ IC50均有不同程度下降（P<0.05）;與對(duì)照組、替莫唑胺、氟桂利嗪?jiǎn)嗡幾饔媒M比較，TMZ聯(lián)合FZ用藥誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率顯著提高。結(jié)論：FZ可抑制膠質(zhì)瘤U87、U251、CHG-5、SHG-4增殖，與TMZ聯(lián)合應(yīng)用后能提高化療效果。

【關(guān)鍵詞】 替莫唑胺; 氟桂利嗪; 膠質(zhì)瘤

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Temozolomide（TMZ）combined with Flunarizine（FZ）on glioma cell lines in vitro.Method：The glioma U87，U251，CHG-5 and SHG-44 cell lines were cultured in Eagles medium，Cell Counting Kit-8（CCK-8）assay was used to evaluate the cell proliferation in glioma cell lines which treated with TMZ combined with FZ either alone or in combination.Result：FZ inhibited the proliferation of glioma cell lines，but it was far less therapeutic effect.In the same kind of cells，the 50% inhibitory concentration（IC50）of FZ in cell lines U87，U251，CHG-5，SHG-44 were（562.3±56.7），（370.5±40.2），（480.9±29.6），（420.5±61.4）μg/mL.The IC50 of TMZ was significantly decreased after different concentrations of FZ combined with TMZ（P<0.05）.Compared with the control group，TMZ and FZ monotherapy group，the apoptotic rate of TMZ combined with FZ induced a significant increase of glioma cells.Conclusion：FZ could inhibit the proliferation of glioma U87，U251，CHG-5 and SHG-4，and it could improve the chemotherapy effect when combined with TMZ.

【Key words】 Temozolomide; Flunarizine; Glioma

First-authors address：The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.03.002

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，占惡性腦瘤的81%，影響膠質(zhì)瘤發(fā)病的因素較多，如基因突變、電離輻射等[1]，最新的權(quán)威報(bào)道，膠質(zhì)瘤發(fā)病率（1～5）/10萬(wàn)，超過(guò)3年的生存率僅5%[2]。約50%膠質(zhì)瘤患者存在癲癇風(fēng)險(xiǎn)，氟桂利嗪（Flunarizine，F(xiàn)Z）為雙氟化哌啶衍生物，是強(qiáng)效的鈣通道拮抗劑，臨床上常用的抗癲癇藥物之一[3]。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是一種口服的烷基化廣譜抗腫瘤藥物，通過(guò)DNA上的鳥(niǎo)嘌呤在O-6或N-7位上誘導(dǎo)DNA烷基化，致使腫瘤細(xì)胞凋亡[4]，其作為臨床上一線的抗腫瘤藥物，能明顯延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者生存期，但Chio等[5]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用替莫唑胺作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)使其產(chǎn)生耐藥性，臨床上同樣見(jiàn)有類似報(bào)道[6]。如何提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性，增強(qiáng)抗腫瘤作用已經(jīng)成為目前研究熱點(diǎn)，而關(guān)于TMZ與FZ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞株的影響目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討體外FZ能否增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性、增強(qiáng)TMZ對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，為臨床治療膠質(zhì)瘤患者提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 流式細(xì)胞儀（BD calibur）、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（上?；蚩萍加邢薰荆?、胎牛血清（Gibco）、Eagle培養(yǎng)基（DMEM）（Hyclone公司）、0.25%胰酶（杭州四季青生物科技有限公司）、超凈工作臺(tái)（美國(guó)貝克曼公司）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（Cell Signaling公司）、TMZ（天士力公司）、FZ（西安楊森制藥有限公司）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、CCK-8溶液（cell counting kit-8，Dojindo）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM的高糖培養(yǎng)基，在室溫下5%CO2的孵育箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞且活性>95%用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞抗增殖試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔3 000個(gè)，預(yù)先置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并長(zhǎng)滿孔底。24 h后將各濃度藥物10 μL加入培養(yǎng)孔，每濃度藥物設(shè)4個(gè)復(fù)孔，空白組（無(wú)細(xì)胞、試劑）4個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組（只有等量溶劑）4個(gè)復(fù)孔。各藥液細(xì)胞培養(yǎng)孔的FZ、TMZ、FZ+TMZ濃度分別為FZ（5、10、20、40、80 μg/mL），TMZ（50、100、200、400、800 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處檢測(cè)光吸收值（optical density，OD值），然后計(jì)算不同濃度的增殖抑制率。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次取均值計(jì)算增殖抑制率和聯(lián)合用藥后TMZ的IC50，

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取同步培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞加入對(duì)照組以及用DMSO配置的FZ、TMZ、FZ+TMZ（FZ終濃度為10、20、40 μg/mL，TMZ的終濃度為100、200、400 μg/mL），每組藥物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照凋亡試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Students t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FZ、TMZ單藥作用于U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞的增殖抑制率比較 FZ單藥對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，但達(dá)不到治療效果，見(jiàn)表1。

2.2 FZ與TMZ聯(lián)合用藥對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用 聯(lián)合處理后TMZ的IC50均有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 TMZ、FZ及其聯(lián)合用藥對(duì)U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞株凋亡率比較 對(duì)照組與各濃度藥物FZ、TMZ、FZ+TMZ培養(yǎng)至24 h后，對(duì)U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

原發(fā)性膠質(zhì)瘤難以根治的原因主要是其具有豐富的血供、高度的浸潤(rùn)性及腫瘤邊界不清等特點(diǎn)[7-8]，手術(shù)切除是目前治療膠質(zhì)瘤的第一選擇方案，但由于腫瘤切除不完全，膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)率極高，預(yù)后效果欠佳，嚴(yán)重危害患者生活質(zhì)量及生命健康[9]。改進(jìn)治療方案及策略，提高膠質(zhì)瘤患者生存期和生活質(zhì)量是臨床工作者亟待解決的問(wèn)題。臨床大樣本數(shù)據(jù)證實(shí)，惡性膠質(zhì)瘤患者行手術(shù)+放療+化療，目前已達(dá)成共識(shí)[10]。而Fisher等[11]在腫瘤放射治療試驗(yàn)（RTOG）0424組證實(shí)，手術(shù)后行放療+TMZ化療較單純行術(shù)后放療，中位生存時(shí)間（MST）從40.5個(gè)月提高到57.9個(gè)月，提高率為43%，三年總體生存率（OS）從54%提高到65%。TMZ早在1980年被合成，且易于通過(guò)血腦屏障，目前成熟應(yīng)用于臨床一線的化療藥[12]，不少學(xué)者報(bào)道，原發(fā)性或復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤術(shù)后患者初次口服TMZ獲得良好效果，但不少患者逐步產(chǎn)生耐藥性[13-14]，因此研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ的治療增敏，有望提高膠質(zhì)瘤術(shù)后患者的治療效果。FZ是一種非選擇性的能阻斷T型和L型Ca離子通道阻斷劑，普遍應(yīng)用于膠質(zhì)瘤伴隨癲癇發(fā)作患者[15]。Lee等[16]曾應(yīng)用10余種抗癲癇藥作用于膠質(zhì)瘤U87、T98G細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)所研究的抗癲癇藥對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用（沒(méi)有一種能達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用），其中以?shī)W卡西平和丙戊酸鈉抑制作用顯著，但兩者的抑制作用濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)臨床以預(yù)防、控制癲癇發(fā)作所需要的藥物濃度，因此該劑量藥物并不能作為抗腫瘤藥物來(lái)推廣使用。Schmeel等[17]在研究多發(fā)性骨髓瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)翼相關(guān)整合位點(diǎn)（WNT）通路在淋巴瘤和骨髓瘤組織細(xì)胞中異?；钴S，而FZ的化學(xué)特性與已知的WNT通路抑制劑相似，在白血病細(xì)胞中具有促凋亡作用。Koller等[18]使用三種WNT抑制劑作用于腎癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，該抑制劑能抑制癌細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（GST），導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平升高，氧化應(yīng)激進(jìn)一步增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，文獻(xiàn)[19-21]認(rèn)為WNT通路抑制劑能增敏抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用。Perin等[22]研究表明，F(xiàn)Z與常用化療藥物聯(lián)用時(shí)，F(xiàn)Z對(duì)腫瘤細(xì)胞膜的分裂融合有明顯的抑制作用，同時(shí)能增強(qiáng)化療藥物的藥物敏感性，不受動(dòng)物組不同腫瘤的影響，化療效果顯著增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Z與TMZ聯(lián)合用藥作用于U87、U251、CHG-5、SHG-44細(xì)胞株可以顯著降低TMZ的IC50，即FZ能起到增敏TMZ的作用，F(xiàn)Z單藥作用于該細(xì)胞，只能起到一定的增殖抑制作用，但達(dá)不到殺滅腫瘤細(xì)胞的效果，這可能是由于FZ作為WTN通路的一種抑制劑，能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶活性，致使谷胱甘肽的蛋白水平高升高，從而增敏TMZ的抗腫瘤作用，這與Koller等[18]研究結(jié)果類似。

綜上所述，F(xiàn)Z作為一種臨床常用的抗癲癇藥，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一定生長(zhǎng)抑制作用，但達(dá)不到細(xì)胞毒效應(yīng)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能增敏TMZ的抗腫瘤作用，因此，臨床上推薦膠質(zhì)瘤術(shù)后患者應(yīng)用TMZ化療的同時(shí)應(yīng)用FZ是一個(gè)不錯(cuò)的治療方案，既起到預(yù)防/治療癲癇的作用，又能提高TMZ的治療效果。但其復(fù)雜的聯(lián)合應(yīng)用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Hu J，Shi B，Liu X，et al.The activation of Toll-like receptor 4 reverses tumor differentiation in human glioma U251 cells via Notch pathway[J].Int Immunopharmacol，2018，64：33-41.

[2] Torres-Bayona S，Aldaz P，Auzmendi-Iriarte J，et al.PR-LncRNA signature regulates glioma cell activity through expression of SOX factors[J].Sci Rep，2018，8（1）：12746.

[3] Sendrowski K，Rusak M，Sobaniec P，et al.Study of the protective effect of calcium channel blockers against neuronal damage induced by glutamate in cultured hippocampal neurons[J].Pharmacol Rep，2013，65（3）：730-736.

[4] Di M A，Sedlarik V，et al.Amphiphilic chitosan-grafted-functionalized polylactic acid based nanoparticles as a delivery system for doxorubicin and temozolomide co-therapy[J].Int J Pharm，2014，474（1-2）：134-145.

[5] Chio C C，Chen K Y，Chang C K，et al.Improved effects of honokiol on temozolomide-induced autophagy and apoptosis of drug-sensitive and -tolerant glioma cells[J].BMC Cancer，2018，18（1）：379.

[6] Reyes-Botero G，Cartalat-Carel S，Chinot O L，et al.Temozolomide Plus Bevacizumab in Elderly Patients with Newly Diagnosed Glioblastoma and Poor Performance Status：An ANOCEF Phase Ⅱ Trial（ATAG）[J].Oncologist，2018，23（5）：524-e44.

[7] Bai Y H，Zhan Y B，Yu B，et al.A Novel Tumor-Suppressor，CDH18，Inhibits Glioma Cell Invasiveness Via UQCRC2 and Correlates with the Prognosis of Glioma Patients[J].Cell Physiol Biochem，2018，48（4）：1755-1770.

[8] Alfonso J C L，Talkenberger K，Seifert M，et al.The biology and mathematical modelling of glioma invasion：a review[J].J R Soc Interface，2017，14（136）：pii20170490.

[9] Guan X，Zhang C，Zhao J，et al.CMTM6 overexpression is associated with molecular and clinical characteristics of malignancy and predicts poor prognosis in gliomas[J].EBioMedicine，2018，35：233-243.

[10] Gupta M，Bansal S，Pruthi D S，et al.Prognostic Factors in Elderly Patients with High-grade Gliomas：A Retrospective Analysis of 24 Cases[J].J Neurosci Rural Pract，2018，9（3）：312-316.

[11] Fisher B J，Hu C，Macdonald D R，et al.Phase 2 study of temozolomide-based chemoradiation therapy for high-risk low-grade gliomas：preliminary results of Radiation Therapy Oncology Group 0424[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2015，91（3）：497-504.

[12] Cousin D，Hummersone M G，Bradshaw T D，et al.Synthesis and growth-inhibitory activities of imidazo[5，1-d]-1，2，3，5-tetrazine-8-carboxamides related to the anti-tumour drug temozolomide，with appended silicon，benzyl and heteromethyl groups at the 3-position[J].Medchemcomm，2018，9（3）：545-553.

[13] St-Coeur P D，Touaibia M，Cuperlovic-Culf M，et al.Leveraging metabolomics to assess the next generation of temozolomide-based therapeutic approaches for glioblastomas[J].Genomics Proteomics Bioinformatics，2013，11（4）：199-206.

[14] Cheng L，Bao S，Rich J N，et al.Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma[J].Biochem Pharmacol，2010，80（5）：654-665.

[15] Gulati P，Muthuraman A，Kaur P，et al.Investigation of the role of non-selective calcium channel blocker（flunarizine）on cerebral ischemic-reperfusion associated cognitive dysfunction in aged mice[J].Pharmacol Biochem Behav，2015，131：26-32.

[16] Lee C Y，Lai H Y，Chiu A，et al.The effects of antiepileptic drugs on the growth of glioblastoma cell lines[J].J Neurooncol，2016，127（3）：445-453.

[17] Schmeel L C，Schmeel F C，Kim Y，et al.Flunarizine exhibits in vitro efficacy against lymphoma and multiple myeloma cells[J].Anticancer Res，2015，35（3）：1369-1376.

[18] Koller C M，Kim Y，Schmidt-Wolf I G，et al.Targeting renal cancer with a combination of WNT inhibitors and a bi-functional peptide[J].Anticancer Res，2013，33（6）：2435-2440.

[19] Mohhammed M K，Shao C，Wang J，et al.Wnt/β-catenin signaling plays an ever-expanding role in stem cell self-renewal，tumorigenesis and cancer chemoresistance[J].Genes & Diseases，2016，3（1）：11-40.

[20] Katoh M，Katoh M.Molecular genetics and targeted therapy of WNT-related human diseases（Review）[J].International Journal of Molecular Medicine，2017，40（3）：587-606.

[21] Yang K，Wang X，Zhang H，et al.The evolving roles of canonical WNT signaling in stem cells and tumorigenesis：Implications in targeted cancer therapies[J].Lab Invest，2016，96（2）：116-136.

[22] Perin P M，Haid S，Brown R J，et al.Flunarizine Prevents Hepatitis C Virus Membrane Fusion in a Genotype-dependent Manner by Targeting the Potential Fusion Peptide within E1[J].Hepatology，2016，63（1）：49-62.

（收稿日期：2018-11-02） （本文編輯：程旭然）