PARP1調(diào)控黑素瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的分析

葛 睿 張 鍵 穆 欣 王麗娟 田 瓊 高田原 梁 艷 孫 靚 牟寬厚

黑素瘤具有高度侵襲性是皮膚腫瘤造成死亡的主要病因[1]。近年來黑素瘤的發(fā)生率逐年提高[2]。早期黑素瘤經(jīng)手術(shù)切除后5年生存率可達(dá)90%以上，然而中晚期黑素瘤5年生存率僅為16%[3,4]。雖然免疫及靶向治療的發(fā)展大大的提高了黑素瘤的治療效果，然而治療過程易發(fā)生耐藥，依然極大的限制了黑素瘤的治療[5,6]。因此，探尋黑素瘤的發(fā)病機(jī)制，在此基礎(chǔ)上積極尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)黑素瘤患者具有極大的意義。

聚二磷酸腺苷核糖多聚酶1[poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase 1，PARP1]作為DNA損傷修復(fù)中的關(guān)鍵分子，其可通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參與調(diào)控基因的表達(dá)[7]。已有研究證實(shí)PARP1與黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，然而其具體機(jī)制尚未完全闡明[8,9]。早期研究為探索PARP1的可能作用機(jī)制，對(duì)其調(diào)控的基因表達(dá)譜進(jìn)行了檢測，該研究發(fā)現(xiàn)PARP1除了可調(diào)控基因表達(dá)水平變化之外，還可引起包括H19在內(nèi)的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)表達(dá)水平變化，提示PARP1可通過調(diào)節(jié)lncRNA表達(dá)水平參與疾病的發(fā)生[10]。那么PARP1是否可通過異常調(diào)控lncRNA表達(dá)水平并進(jìn)一步參與黑素瘤發(fā)病目前尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究擬在既往研究的基礎(chǔ)上通過lncRNA芯片篩查由PARP1調(diào)控的差異性lncRNA，為進(jìn)一步探討PARP1參與黑素瘤發(fā)病的機(jī)制提供線索及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.細(xì)胞系與主要試劑:人惡性黑色素瘤細(xì)胞A2058購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American typeculture collection，ATCC)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol購自美國Invitrogen公司；Lipofectamine 3000購自美國Thermo Fisher公司；干涉片段購自中國Genepharma公司；β-actin引物購自生工生物；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自日本TaKaRa公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)。細(xì)胞系為貼壁生長，待生長融合度達(dá)80%時(shí)，用2.5%的胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取適量A2058細(xì)胞接種于6孔板中至融合率達(dá)70%～90%，將合成的PARP1及對(duì)照干涉片段經(jīng)Lipofectamine 3000介導(dǎo)轉(zhuǎn)入A2058細(xì)胞中，具體操作見脂質(zhì)體試劑說明。

3.總RNA的抽提：采用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的抽提。每毫升Trizol中加入200μl的氯仿萃取，將無色上清液轉(zhuǎn)移帶一個(gè)新的離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀并以12000r/min的速率離心10min，并用75%乙醇洗滌。棄上清液，室溫干燥RNA沉淀，用DEPC處理過的水溶解沉淀，定量備用。

4.寡核苷酸芯片雜交:每樣品取100～500ng總RNA，用以T7-Oligo(dT)Promoter引物反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板，在T7 Enzyme Mix反應(yīng)下，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記cRNA。以cRNA為模板，Random Primer為引物，在CbcScriptⅡ酶條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物為模板，Random Primer為引物，用Klenow Fragment酶合成cDNA互補(bǔ)鏈并摻入帶有熒光基團(tuán)的dNTP。帶有熒光基團(tuán)的DNA與博奧晶典長鏈非編碼 RNA 芯片雜交。雜交后芯片清洗染色，采用Agilent 芯片掃描儀(G2565CA)掃描信號(hào)。

5.RT-PCR檢測:每樣品取1μg總RNA，采用TaKaRa公司一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。(1)PCR反應(yīng)體系：正向引物及反向引物各1μl，SYBR 10μl，RNA模板2μl，去離子水6μl。振蕩后，短暫離心。(2)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，(95℃ PCR反應(yīng)5s，60℃退火延伸30s，72℃延伸30s)×40個(gè)循環(huán)。(3)lnc-TSPAN14-2:3上游引物:5′-TGCTGAGGCTCCAGAAGT-3′，下游引物:5′-ACCTAATGGGACCCTTTC-3′，lnc-KCNH5-1:1上游引物:5′-TACCAGAGCCATCGGGAGT-3′，下游引物:5′-AAACTGTGACACGAACGGGA-3′，GAS1RR:7上游引物：5′-TAGTGGTTGCTTTAGGGTTT-3′，下游引物:5′-AGGAGGTCATTAACACGC-3′，BANCR上游引物:5′-TTCCTTAGGGTCAGGGGTCT-3′，下游引物:5′-GATTGGGACCCTTTTCTGGT-3′。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PARP1干涉效率檢測：將PARP1干涉片段或?qū)φ掌雾槙r(shí)轉(zhuǎn)染A2058細(xì)胞，Western blot法及RT-PCR檢測PARP1的干涉效率。結(jié)果可見PARP1干涉片段轉(zhuǎn)染后48h可顯著抑制A2058細(xì)胞內(nèi)PARP1蛋白及mRNA表達(dá)水平(圖1)。

圖1 Western blot法及RT-PCR
檢測PARP1干涉效率
A.Western blot法檢測PARP1干涉后PARP1蛋白表達(dá)水平；B.RT-PCR檢測PARP1干涉后PARP1 mRNA表達(dá)水平

2.芯片雜交結(jié)果：將PARP1干涉組及對(duì)照組A2058黑素瘤細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行l(wèi)ncRNA芯片雜交，PARP1干涉組與對(duì)照組比較，差異>2倍的lncRNA共123條，包括升高的55條及降低的68條(表1)。

3.RT-PCR驗(yàn)證差異性表達(dá)的lncRNA：筆者隨機(jī)選取了3個(gè)表達(dá)差異明顯的lncRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。其lncRNA ID號(hào)分別TCONS_00018255、ENST00000554921.1及TCONS_00016044， 應(yīng)用LNCipedia數(shù)據(jù)庫獲得其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本名稱分別為：lnc-TSPAN14-2:3、lnc-KCNH5-1:1、GAS1RR:7。與對(duì)照組比較lnc-TSPAN14-2：3 在PARP1干涉細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而lnc-KCNH5-1:1及GAS1RR:7 在PARP1干涉細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)(圖2)。該檢測結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本一致。說明芯片結(jié)果如實(shí)反映了PAPR1干涉后A2058細(xì)胞lncRNA表達(dá)的變化情況。

4.RT-PCR檢測黑素瘤相關(guān)lncRNA的表達(dá)：在差異性表達(dá)的lncRNA中筆者發(fā)現(xiàn)存在已證實(shí)與黑素瘤惡性表型相關(guān)的lncRNA ID TCONS_00016342 即目前已知的lncRNA BANCR并對(duì)其進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。與對(duì)照組比較，PARP1干涉組可顯著抑制BANCR表達(dá)(圖3)。證實(shí)PARP1可促進(jìn)黑素瘤相關(guān)lncRNA BANCR的表達(dá)。

討 論

lncRNA是一群長度大于200bp的非編碼RNA分子[11]。研究表明lncRNA具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并可通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA編輯、microRNA吸附、翻譯調(diào)節(jié)等多種作用機(jī)制參與調(diào)控基因表達(dá)[12]。因此，lncRNA的表達(dá)或功能異常與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)[13,14]。大量研究證實(shí)lncRNA的異常表達(dá)可促進(jìn)黑素瘤的惡性轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)與原發(fā)黑素瘤相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的黑素瘤高表達(dá)lncRNA HOTAIR[15]。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)敲降HOTAIR表達(dá)可抑制黑素瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力[16]。最近的研究中發(fā)現(xiàn)MALAT1亦在黑素瘤組織中高表達(dá)并具有促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞侵襲的作用[17,18]。Flockhart等[19]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA BANCR在黑素瘤組織中高表達(dá)并可促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞遷移。此外進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)BANCR還可通過活化MAPK通路促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖及小鼠體內(nèi)成瘤作用[20]。筆者的研究證實(shí)干涉PARP1水平可顯著抑制黑素瘤細(xì)胞內(nèi)BANCR的表達(dá)，說明PARP1可通過促進(jìn)BANCR表達(dá)介導(dǎo)黑素瘤的惡性轉(zhuǎn)化。此外，通過lncRNA芯片還篩選出大量由PARP1調(diào)控的lncRNA分子并通過RT-PCR對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果證實(shí)PARP1可促進(jìn)lnc-KCNH5-1:1及GAS1RR:7表達(dá)并抑制lnc-TSPAN14-2:3的表達(dá)水平。目前對(duì)于lnc-TSPAN14-2:3、lnc-KCNH5-1:1及GAS1RR:7的具體作用及其與腫瘤的關(guān)系還未見相關(guān)報(bào)道，對(duì)這些分子及其他由PARP1調(diào)控的lncRNA分子進(jìn)行深入研究有望為黑素瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

表1 PARP1調(diào)控的差異性表達(dá)lncRNA

圖2 RT-PCR驗(yàn)證差異性表達(dá)lncRNA

圖3 RT-PCR檢測BANCR表達(dá)

與mRNA類似lncRNA的表達(dá)同樣也受到轉(zhuǎn)錄機(jī)制的調(diào)控[21]。比如，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMT)可通過甲基化lncRNA MEG3的啟動(dòng)子區(qū)從而抑制MEG3的表達(dá)水平[22]。在低氧條件下，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 3，HDAC3)可使lncRNA LET分子啟動(dòng)子區(qū)H3及H4去乙?；M(jìn)一步抑制LET的表達(dá)水平[23]。此外，一些lncRNA的表達(dá)還受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AK019103分子啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，而抑制NF-κB活性也證實(shí)可抑制AK019103表達(dá)[24]。Dinger等發(fā)現(xiàn)從胚胎干細(xì)胞多潛能分化到細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)活動(dòng)中均存在轉(zhuǎn)錄因子包括p53、NF-κB、Sox2、Pou5f1等介導(dǎo)的lncRNA的表達(dá)。筆者研究發(fā)現(xiàn)PARP1可調(diào)控一系列l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平，然而其具體機(jī)制尚不明確。鑒于PARP1具有催化核糖二磷酸腺苷(adenosine diphosphate ribose，ADPR)共價(jià)結(jié)合至自身或其他受體蛋白上形成多聚核糖二磷酸腺苷(poly ADP-ribose，PAR)的功能。研究發(fā)現(xiàn)PARP1可通過PAR基化修飾p53、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子從而參與調(diào)控多種基因表達(dá)[25]。提示PARP1可能通過類似機(jī)制調(diào)控lncRNA的表達(dá)。綜上所述，筆者研究發(fā)現(xiàn)在黑素瘤細(xì)胞中存在大量受PARP1調(diào)控的lncRNA分子，PARP1可能通過調(diào)控BANCR及其他lncRNA的表達(dá)參與介導(dǎo)黑素瘤的惡性轉(zhuǎn)化。