肝素-泊洛沙姆407新材料應(yīng)用進(jìn)展*

任少琳，符馨尹，裔文靜

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，?？?570203)

泊洛沙姆，商品名Pluronic F127，是一種溫敏型即位凝膠的賦形劑，其系列產(chǎn)品在多種領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，隨著對泊洛沙姆的研究不斷深入，以泊洛沙姆作為賦形劑的溫敏型材料也得到了多方面發(fā)展[1]。肝素-泊洛沙姆407是目前新興的具有高親和性、緩釋、定點(diǎn)釋放等多種功能為一體的多聚物材料。該材料不僅具有肝素的抗凝溶栓特性，還結(jié)合了溫敏特質(zhì)，提高血管縫合術(shù)的成功率[2]。隨著研究進(jìn)展，肝素-泊洛沙姆作為一種高分子共聚物材料在靶向及定點(diǎn)釋放等方面也有所涉及。筆者就肝素-泊洛沙姆407的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 肝素-泊洛沙姆407材料的結(jié)構(gòu)及合成

泊洛沙姆407(poloxamer 407，Pluronic F127) 是由不同比例的聚氧乙烯和聚氧丙烯組成的非離子型表面活性劑，平均相對分子質(zhì)量約為12 600。泊洛沙姆具有特殊的反向熱膠凝作用，即低溫時(shí)(4～5 ℃)為液體，體溫(37 ℃)下轉(zhuǎn)變?yōu)槟z[3]。肝素及低分子肝素是一種敏感的氨基葡聚糖，常與蛋白或其他肽類物質(zhì)結(jié)合，具有緩釋及靶向作用。目前文獻(xiàn)報(bào)道的肝素-泊洛沙姆407材料合成方法的核心為將低分子肝素或普通肝素粉制備成單端胺基肝素后，與泊洛沙姆407在24 h室溫條件下經(jīng)EDC/NHS催化合成具有新結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，并經(jīng)過濾膜透析3 d，保留相對分子量在14 000內(nèi)的化合物后冷凍干燥[4]?；衔锓勰┙?jīng)紅外光譜和磁共振同時(shí)鑒定，可發(fā)現(xiàn)該化合物不僅具有肝素和泊洛沙姆407的特征峰，也有因PPO基團(tuán)上-CH3、-CH，-CH2和PEO基團(tuán)上-CH2的特征性化學(xué)位移產(chǎn)生的新特征吸收峰。經(jīng)驗(yàn)證，合成后的肝素-泊洛沙姆407材料不僅具備60%低分子肝素的活性，還具有泊洛沙姆的溫敏性，即低于體溫(37 ℃)為液體，高于體溫(40 ℃)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z體。同時(shí)肝素與泊洛沙姆407的合成也促進(jìn)了其與多種生物活性物質(zhì)的親和力，結(jié)合力相較泊洛沙姆407更強(qiáng)。這樣的特性使肝素-泊洛沙姆407可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療中，例如輔助血管縫合、作為多種疾病治療藥物的載體起到靶向及緩釋作用。

2 肝素-泊洛沙姆407材料的應(yīng)用進(jìn)展

2.1血管縫合術(shù)中的應(yīng)用 血管縫合術(shù)是各種血管手術(shù)的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的手工縫合技術(shù)要求較高，且許多因素如血管再狹窄、血管內(nèi)膜的增生、血栓的形成以及外來物質(zhì)的干擾等也給手術(shù)的操作帶來了挑戰(zhàn)，也不適于小血管及微血管的吻合[5]。斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究者提出應(yīng)用泊洛沙姆407 凝膠結(jié)合醫(yī)用黏合劑使用，可以解決顯微血管吻合術(shù)黏合法的瓶頸問題[6]。泊洛沙姆有一種獨(dú)特性質(zhì)，在低溫下是液體，受熱后變成固體，過程是可逆的，將泊洛沙姆407加熱到高于體溫，使它變成固體，用于撐開血管。溫度下降后泊洛沙姆407變成液體，不會阻塞血管，但還是存在必須合用白蛋白來控制膠凝溫度、輔以抗凝劑防止栓塞形成等缺陷[7]。然而肝素-泊洛沙姆407既改進(jìn)泊洛沙姆407凝膠的不足，又能克服傳統(tǒng)吻合方法存在的吻合口狹窄和栓塞等問題，是目前研究的熱點(diǎn)。王艷等[8]研究顯示肝素-泊洛沙姆超聲微泡可以增強(qiáng)肝素的溶栓作用，同時(shí)減少肝素有效溶栓的劑量，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，這提示肝素-泊洛沙姆可能有助于解決血管吻合術(shù)中出現(xiàn)的困難。同時(shí) ?ZER等[9]研究也顯示，在泊洛沙姆407中加入肝素，該凝膠的溫敏現(xiàn)象可在體溫時(shí)呈固態(tài)，在斷口處撐開血管，加快了微血管縫合手術(shù)時(shí)間，1周后，加入了肝素的泊洛沙姆407組血管壁更薄，血流通暢度更高。提示了該種復(fù)合物質(zhì)對無縫合線血管縫合手術(shù)益處較大。ZHAO等[4]研制出了肝素-泊洛沙姆407原位凝膠，并將其應(yīng)用于兔頸靜脈血管吻合術(shù)中，該凝膠具有與泊洛沙姆407不同的溫敏特性，在高于體溫時(shí)呈現(xiàn)固態(tài)，注射在血管斷口處可利于撐開血管，同時(shí)縫合后撤離熱源，凝膠降至體溫時(shí)呈現(xiàn)液態(tài)，不堵塞血管。影像學(xué)及病理檢查結(jié)果顯示肝素-泊洛沙姆407輔助縫合術(shù)較傳統(tǒng)的手工縫合技術(shù)更高效，同時(shí)還可顯著改善兔頸靜脈血管縫合處內(nèi)皮損傷，溶解斷口處形成的血栓，促進(jìn)血管功能的恢復(fù)。

2.2藥物載體的應(yīng)用

2.2.1抗癌藥物的靶向作用 肝素-泊洛沙姆407凝膠具有靶向作用，與抗癌藥物結(jié)合能起到靶向治療癌癥、減小不良反應(yīng)的作用。CHOI等[10]自組裝了肝素-泊洛沙姆407納米凝膠，并與核糖核酸酶A(ribonuclease A，RNase A) 結(jié)合用于抗癌治療。結(jié)果顯示RNase A與肝素-泊洛沙姆407凝膠結(jié)合力強(qiáng)，具有良好的載藥率。同時(shí)肝素-泊洛沙姆407納米凝膠細(xì)胞內(nèi)吞及肝素的細(xì)胞核滲透能力顯著，可濃集于人宮頸癌細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞毒性方面，肝素-泊洛沙姆407因肝素與泊洛沙姆407發(fā)生化學(xué)耦聯(lián)后作用減弱，自身幾乎無細(xì)胞毒性，而隨著納米凝膠內(nèi)RNase A濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸減弱，顯示出了細(xì)胞毒性。TONG等[11]將順鉑與肝素-泊洛沙姆407納米凝膠結(jié)合，結(jié)果顯示該凝膠具有較高的載藥率(42.5%)，同時(shí)具有抑制人肺腺癌細(xì)胞NCI-H460的作用。另外，該順鉑-肝素-泊洛沙姆407納米凝膠較之單純的順鉑具有釋放更緩慢及降低細(xì)胞毒性的作用。上述研究提示，肝素-泊洛沙姆407是一種安全性高、載藥率高、結(jié)合能力強(qiáng)的靶向藥物載體，可用于癌癥靶向治療。

2.2.2血管修復(fù)作用 藥劑學(xué)研究領(lǐng)域針對肝素-泊洛沙姆407與生長因子的釋放過程及原理進(jìn)行了探索。 YOON等[12]及CHOI等[13]將堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-fibroblast growth factor，bFGF)加入肝素-泊洛沙姆407復(fù)合物及肝素-泊洛沙姆/殼聚糖中，發(fā)現(xiàn)加入復(fù)合物中的生長因子較與加入單純的泊洛沙姆中的生長因子釋放速度更緩慢，且無爆釋現(xiàn)象，其原理與肝素中有bFGF的特異結(jié)合位點(diǎn)，可形成相互作用有關(guān)。其釋放生長因子的速度不僅受游離及結(jié)合的bFGF濃度影響，還與肝素同泊洛沙姆及殼聚糖的結(jié)合有關(guān)。帶負(fù)電荷的肝素與帶正點(diǎn)的聚合物間可形成較強(qiáng)的靜電力，使bFGF/肝素釋放緩慢，而單純的bFGF與聚合物則結(jié)合較弱，釋放速度增加。同時(shí)bFGF-肝素-泊洛沙姆407凝膠及bFGF-肝素-泊洛沙姆407-殼聚糖凝膠通過體內(nèi)及體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其增殖細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)量的能力均顯著強(qiáng)于bFGF-泊洛沙姆407組，且該凝膠皮下移植進(jìn)背部后作用可持續(xù)15 d，起到長效組織修復(fù)的作用。

YANG等[14]將bFGF及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)165質(zhì)粒DNA與肝素-泊洛沙姆407結(jié)合制成超分子納米凝膠，并將其注入人內(nèi)皮祖細(xì)胞中，結(jié)果顯示該凝膠能在體外促進(jìn)人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化成內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)給下肢缺血小鼠模型肌內(nèi)注射凝膠后，同樣促進(jìn)了小鼠下肢血管的生成。 WU等[15]使用C57BL/6小鼠進(jìn)行全層皮膚切除處理后分別將與肝素-泊洛沙姆結(jié)合的酸性成纖維細(xì)胞生長因子(a-fibroblast growth factor，aFGF)和bFGF在傷口上涂抹給藥。結(jié)果顯示肝素-泊洛沙姆結(jié)合的aFGF和bFGF均可促進(jìn)小鼠傷口愈合，并促進(jìn)血管的生成使組織再上皮化。但是介于aFGF和bFGF表面所帶電荷的不同，帶正電荷的bFGF與肝素-泊洛沙姆凝膠結(jié)合更強(qiáng)，導(dǎo)致其較aFGF更難釋放，治療作用稍差。

2.2.3脊髓修復(fù)靶向作用 肝素-泊洛沙姆407材料目前的研究熱點(diǎn)還集中在脊髓損傷的修復(fù)中。在現(xiàn)有治療脊髓損傷的方法中生長因子發(fā)揮著重要作用，可顯著促進(jìn)神經(jīng)的恢復(fù)。然而，因?yàn)槠淇诜锢枚鹊停Ａ魰r(shí)間短，且通過血脊髓屏障量小等問題也限制了其使用[16]。

將肝素-泊洛沙姆407凝膠與神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)及膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)結(jié)合后，運(yùn)用體外PC12細(xì)胞測定NGF的細(xì)胞攝取率和細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示在肝素-泊洛沙姆407中，NGF及GDNF具有完整的形態(tài)并發(fā)揮穩(wěn)定的生物活性，肝素-泊洛沙姆407增強(qiáng)了NGF及GDNF細(xì)胞攝取率，對細(xì)胞幾乎無毒性[17-18]。為進(jìn)一步探索其神經(jīng)元修復(fù)作用，將NGF及GDNF-肝素-泊洛沙姆407凝膠在脊髓損傷大鼠中進(jìn)行損傷部位的原位注射，結(jié)果顯示，NGF及GDNF-肝素-泊洛沙姆407組較之單純的NGF及GDNF組和肝素-泊洛沙姆407組更具有神經(jīng)元功能及形態(tài)的修復(fù)作用，有效抑制了膠質(zhì)瘢痕的形成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時(shí)GDNF-肝素-泊洛沙姆407凝膠在體外神經(jīng)細(xì)胞損傷模型中也具有較好的細(xì)胞攝取率及細(xì)胞突觸修復(fù)作用，并具有劑量依賴性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示肝素-泊洛沙姆407作為載體可顯著發(fā)揮NGF及GDNF的治療作用。

WANG等[19]將肝素-泊洛沙姆407凝膠與aFGF結(jié)合，并對脊髓損傷大鼠進(jìn)行原位注射，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相較于單純的NGF組和肝素-泊洛沙姆407組，NGF-肝素-泊洛沙姆407凝膠可顯著改善血腦脊髓屏障，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)髓鞘及軸突復(fù)原，減少因脊髓損傷造成的反應(yīng)性膠質(zhì)化現(xiàn)象，抑制炎癥細(xì)胞擴(kuò)散及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路破壞，促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)。另外，相比單純的泊洛沙姆凝膠，肝素的-SH鍵可增加凝膠與生長因子的結(jié)合率，同時(shí)具有緩釋作用。同時(shí)肝素-泊洛沙姆這種溫敏性凝膠還可在體溫時(shí)呈現(xiàn)液態(tài)，原位注射時(shí)能保護(hù)生長因子不被體內(nèi)的酸、酶等物質(zhì)破壞及熱滅活，同時(shí)不影響血管的生理功能。

目前對于治療脊髓損傷的研究熱點(diǎn)開始集中在細(xì)胞因子與一種非細(xì)胞脊髓骨架結(jié)合后，再加入肝素-泊洛沙姆407凝膠中，形成生物復(fù)合凝膠，該種凝膠較原先單純的生長因子-肝素-泊洛沙姆407凝膠釋放更為緩慢，更能有效集中于受損脊髓部位，達(dá)到長效的治療效果。XU等[20-21]將細(xì)胞因子纖維生長因子-2(fbroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)及bFGF通過冷處理方式與脊髓非細(xì)胞基質(zhì)或骨架結(jié)合后，再加入肝素-泊洛沙姆407形成FGF-2- dscECM-HP和bFGF-ASC-HP新型復(fù)合凝膠。該凝膠不僅具有肝素-泊洛沙姆407的溫敏特征和原有生長因子-肝素-泊洛沙姆407凝膠的神經(jīng)元修復(fù)及抗氧化還原的作用，同時(shí)該種復(fù)合基質(zhì)還為肝素-泊洛沙姆407提供了微小的儲存位點(diǎn)，使得生長因子能在體內(nèi)儲存并且能夠更持久、集中釋放于脊髓損傷部位。肝素-泊洛沙姆407與多種生物基質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合基質(zhì)將是未來研究的熱點(diǎn)。

2.2.4宮腔靶向及緩釋治療作用 17β-雌二醇作為雌激素可有效提高子宮內(nèi)膜修復(fù)作用，恢復(fù)子宮腔功能，但該藥生物利用度低，選擇性低，不僅限制了藥物的應(yīng)用，也增加了血栓及惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[22]。ZHANG等[23]將肝素-泊洛沙姆407作為載體與17β-雌二醇結(jié)合，不僅克服了17β-雌二醇溶液低生物利用度及低選擇性的缺點(diǎn)，同時(shí)釋放更為緩慢，起到緩釋作用。將17β-雌二醇-肝素-泊洛沙姆407注射進(jìn)入右側(cè)宮腔部位，結(jié)果顯示該凝膠可顯著改善宮腔黏連大鼠的宮腔腺體數(shù)量及纖維化面積，通過發(fā)揮PI3K/Akt和ERK1/2通路作用達(dá)到靶向治療疾病的效果。

近年來，細(xì)胞因子對子宮損傷的修復(fù)作用也引起了廣泛關(guān)注。XU等[24]研究顯示，將角化細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)加入至肝素-泊洛沙姆407凝膠結(jié)合后進(jìn)行子宮腔內(nèi)注射，結(jié)果顯示該凝膠相較于單純細(xì)胞因子溶液更能緩慢集中釋放于受損的子宮內(nèi)膜部位，KGF-肝素-泊洛沙姆407凝膠可通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺管上皮細(xì)胞及子宮腔上皮細(xì)胞的增殖及自噬作用，促進(jìn)子宮血管生成和受損子宮修復(fù)。兩者結(jié)合起到了增強(qiáng)藥效的作用。另外，該學(xué)者研究證實(shí)，將帶有負(fù)電荷的肝素-泊洛沙姆407與帶有正電荷的ε-聚賴氨酸(ε-polylysine)結(jié)合形成復(fù)合凝膠后與KGF結(jié)合，該復(fù)合凝膠較之單純的肝素-泊洛沙姆407凝膠具有更好的生物膜附著力，同時(shí)因?yàn)橄魅趿烁嗡?泊洛沙姆407的負(fù)電荷對生長因子的結(jié)合力，改變生長因子釋放速率，導(dǎo)致KGF釋放速率加快，能在凝膠黏附時(shí)迅速釋放藥物起到修復(fù)子宮內(nèi)膜的作用[25]。

3 結(jié)束語

肝素-泊洛沙姆407是一種新型溫敏型高分子材料，研究者在多種實(shí)驗(yàn)中探索該材料的用途，其中肝素-泊洛沙姆在血管外科吻合術(shù)中的應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn)，其溫敏特質(zhì)和對斷口處的恢復(fù)作用將使之成為外科輔助治療的新手段。同時(shí)，作為藥用載體，肝素-泊洛沙姆可與多種生長因子、核糖核酸及激素結(jié)合，在維持治療劑量的同時(shí)，具有緩釋及靶向作用?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)已報(bào)道了肝素-泊洛沙姆407材料具有較低的細(xì)胞毒性，未來可能對肝素-泊洛沙姆407材料的安全性及其與生長因子結(jié)合的制劑用于外科手術(shù)，及與其他材料結(jié)合形成復(fù)合制劑用于靶向治療疾病作進(jìn)一步研究。