刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病HGF/C-Met通路的調(diào)控作用*

康小龍，何承輝，盧 軍

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥研室，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥劑室，烏魯木齊 830004)

系統(tǒng)性硬皮病(systemic sclerosis,SSc)是一種結(jié)締組織疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚和內(nèi)臟器官纖維化、免疫異常及血管病變[1-2]。刺山柑總生物堿系本課題組從新疆地產(chǎn)藥材刺山柑中提取的有效成分，擬用于SSc的治療。本實(shí)驗(yàn)觀察了刺山柑總生物堿對SSc組織纖維化密切相關(guān)的肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)/C-Met通路的調(diào)控作用，以探討刺山柑總生物堿改善SSc組織纖維化的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取清潔級雌性BALB/c小鼠90只，平均體質(zhì)量(22.1±1.9)g，購自新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心，合格證號：SCXK(新)2015-0027。

1.1.2藥物 刺山柑藥材：新疆麥迪森維藥有限公司飲片廠，由新疆藥物研究所何江研究員鑒別為正品；鹽酸博萊霉素粉針劑：日本化藥株式會社，批號430312；青霉胺片：上海信誼藥廠，批號052130503。

1.1.3試劑 小鼠HGF ELISA試劑盒(批號201503)，購自美國R&D公司；小鼠C-Met ELISA試劑盒(批號J27030166)，購自武漢華美生物科技公司；二辛可寧酸蛋白定量試劑盒(批號20150223)，購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。HGF抗體、α-tubulin抗體，購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG-HRP，購自美國Cell Signaling公司。

1.1.4儀器 酶標(biāo)儀(型號Multiskan Spectrum)、低溫離心機(jī)(型號Multifuge X1R)，美國Thermo Fisher公司；Western blot設(shè)備(型號Mini-protean Tetra System)，美國Biorad公司。

1.2方法

1.2.1刺山柑總生物堿的提取 將曬干粉碎的刺山柑果實(shí)，加10倍體積量95%乙醇80 ℃水浴回流提取30 min，提取2次，過濾，濾液備用，兩次的濾液減壓濃縮至藥材：藥液(g/g)質(zhì)量比為2∶1。提取物濃縮干燥后經(jīng)紫外分光光度法(UV)測得刺山柑總生物堿水平為32.0%(w/w)，高效液相色譜法(HPLC)測得鹽酸水蘇堿水平為2.2%(w/w)。

1.2.2刺山柑總生物堿乳膏制備方法 在水浴中將白凡士林、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、月桂氮卓酮加熱至90 ℃使其熔融，作為油相；水浴加熱刺山柑總生物堿提取物濃縮液與甘油混合物，溫度達(dá)到90 ℃時(shí)作為水相；乳化劑為在適量水中加入羥基苯甲酸乙酯、十二烷基硫酸鈉，水浴加熱使其溶解；當(dāng)水相、油相溫度降至85 ℃時(shí)，依次將水相和乳化劑加入油相中，邊加邊攪拌至乳化完全。

1.2.3小鼠SSc模型的建立及給藥方法 90只BALB/c小鼠，分為對照組、SSc模型組、低(225 mg/kg)、中(450 mg/kg)、高(900 mg/kg)劑量刺山柑總生物堿組及青霉胺(125 mg/kg)組，每組15只，博萊霉素皮下注射法建立SSc模型[3-4]：將小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛剃除，鹽酸博萊霉素粉針劑用生理鹽水配成濃度為300 μg/mL的藥液，除對照組背部皮下注射生理鹽水外，其余各組注射博萊霉素30 μg/d，注射4周后，刺山柑總生物堿乳膏外敷低、中、高刺山柑總生物堿組小鼠背部，青霉胺組還給予青霉胺灌胃，對照組和SSc模型組外敷不含藥基質(zhì)乳膏，每天1次，連續(xù)給藥8周。

1.2.4Western blot檢測小鼠皮膚組織HGF表達(dá) 給藥8周后，取小鼠背部皮膚，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，組織勻漿機(jī)研磨成組織勻漿，冰浴裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，二辛可寧酸試劑盒定量上清液中蛋白水平，調(diào)整每孔上樣量，使每個(gè)加樣孔中總蛋白量相同，樣品與上樣緩沖液混合，95 ℃水浴中10 min變性蛋白，上樣后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，Tris-HCl-Tween洗膜后，加入HGF一抗(按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影，以α-tubulin作為內(nèi)參，Image J軟件掃描條帶，比較蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.5ELISA實(shí)驗(yàn)檢測小鼠皮膚組織HGF和C-Met水平 給藥8周后，取小鼠背部皮膚，加入生理鹽水，組織勻漿機(jī)研磨成組織勻漿，4 000 r/min離心10 min后提取上清液。上清液中HGF和C-Met水平采用ELISA試劑盒測定，以每毫升上清液中總蛋白水平(二辛可寧酸蛋白定量試劑盒測定)濃度校正ELISA結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠皮膚組織HGF表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，SSc模型組小鼠皮膚組織HGF表達(dá)減弱(P<0.01)；與SSc模型組比較，中、高劑量刺山柑總生物堿組及青霉胺組小鼠皮膚組織HGF表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，見圖1。ELISA結(jié)果顯示，與對照組比較，SSc模型組小鼠皮膚組織HGF水平明顯降低(P<0.01)；與SSc模型組比較，中、高劑量刺山柑總生物堿組及青霉胺組HGF水平明顯升高(P<0.05)；中、高劑量刺山柑總生物堿組及青霉胺組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

1:對照組；2:SSc模型組；3:低劑量刺山柑總生物堿組；4:中劑量刺山柑總生物堿組；5:高劑量刺山柑總生物堿組；6:青霉胺組；a:P<0.01，與對照組比較；b:P<0.05，與SSc模型組比較

圖1各組小鼠皮膚組織HGF表達(dá)比較

2.2各組小鼠皮膚組織C-Met水平比較 與對照組比較，SSc模型組小鼠皮膚組織C-Met水平明顯降低(P<0.01)；與SSc模型組比較，中、高劑量刺山柑總生物堿組及青霉胺組小鼠皮膚組織C-Met水平升高(P<0.05)，中、高劑量刺山柑總生物堿組及青霉胺組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠皮膚組織HGF及C-Met水平比較

a:P<0.01，與對照組比較；b:P<0.05，與SSc模型組比較

3 討 論

SSc是一種表現(xiàn)為多組織炎癥和纖維化的慢性自身免疫性疾病，目前認(rèn)為SSc是由于過度活化的成纖維細(xì)胞合成膠原、纖維連接蛋白和糖胺聚糖等增多，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，引發(fā)組織纖維化[5-6]。

HGF主要由內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等間質(zhì)來源的細(xì)胞生成。HGF通過與細(xì)胞膜上特異性受體C-Met結(jié)合，激活下游信號通路后發(fā)揮其生物學(xué)作用，HGF是一種抗纖維化細(xì)胞因子，它通過抑制纖維化和促進(jìn)血管生成，在修復(fù)受損的組織中起一定作用[7]。HGF通過抑制膠原生成，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，降解細(xì)胞外基質(zhì)等作用而發(fā)揮抗纖維化作用[8-9]。

在SSc的研究中表明HGF/C-Met通路具有明顯的抗纖維化作用。IWASAKI等[10]證實(shí)轉(zhuǎn)染HGF基因后緊皮型(TSK/+)小鼠的皮膚硬化得到明顯改善；WU等[11]研究發(fā)現(xiàn)用人類HGF基因轉(zhuǎn)染至經(jīng)博來霉素處理過的小鼠，不僅可以阻止皮膚硬化和肺纖維化進(jìn)程，而且能有效改善皮膚硬化癥狀；KAWAGUCHI等[12]證實(shí)HGF能抑制SSc成纖維細(xì)胞膠原產(chǎn)生；SHERRIFF等[13]也發(fā)現(xiàn)SSc成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原及結(jié)締組織生長因子的合成可被HGF抑制；BOGATKEVICH等[14]研究發(fā)現(xiàn)美國非洲裔SSc患者支氣管肺泡灌洗液、血清及體外肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中HGF濃度較白種人顯著降低，且HGF誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞C-Met受體磷酸化水平在非洲裔SSc患者也明顯低于白種人，推測這可能是美國的非洲裔SSc患者病情較重及預(yù)后差的原因，同時(shí)也表明HGF/C-Met與SSc病程密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)SSc模型組小鼠皮膚組織HGF和C-Met表達(dá)較對照組明顯減少，中、高劑量刺山柑總生物堿組HGF和C-Met表達(dá)較對照組明顯增多，而與青霉胺組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示刺山柑總生物堿對SSc HGF與C-Met水平的異常降低有一定升高作用，其作用與青霉胺相當(dāng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)刺山柑總生物堿可增加SSc小鼠皮膚組織HGF和C-Met表達(dá)，本課題組已經(jīng)證實(shí)：給SSc小鼠外用刺山柑總生物堿乳膏后，小鼠皮膚、肺組織炎癥和纖維化等病理改變得到改善[15]，增厚的真皮鱗狀上皮變薄，并可下調(diào)皮膚組織羥脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)[15-16]，提示刺山柑總生物堿可能通過上調(diào)HGF/C-Met通路，抑制膠原生成，降解細(xì)胞外基質(zhì)，改善SSc皮膚纖維化。