基于脂類代謝組學(xué)研究對乙酰氨基酚對小鼠藥物性肝損傷的早期毒性Δ

楊虹，彭芳，劉剛，時京珍，錢海兵

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)科研處，貴陽 550002；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，貴陽 550002）

我國是藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）的高發(fā)國家，每年發(fā)生率至少為23.80/10萬人[1]。對乙酰氨基酚（APAP）是常見的復(fù)方抗感冒藥成分，也是導(dǎo)致DILI的常見藥物，由過量APAP導(dǎo)致的肝損傷發(fā)生機制復(fù)雜，涉及毒性產(chǎn)物生成、氧化應(yīng)激、線粒體損傷以及炎癥反應(yīng)等病理生理過程[2]。目前，臨床對DILI的診斷仍有很多不足，傳統(tǒng)檢測指標(biāo)如谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）等存在敏感性低、特異性差的特點[3]，尚未找到理想的DILI生物標(biāo)志物。

系統(tǒng)生物學(xué)方法為研究疾病發(fā)生機制提供了新的可能。目前，采用蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等方法發(fā)現(xiàn)，miR-122、miR-155、谷氨酸脫氫酶等在DILI的診斷方面有較高的價值[4-5]。但最新版《藥物性肝損傷診治指南》（2015年版）指出，新生物標(biāo)志物在DILI診斷中的貢獻還有待進一步研究[6]。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后誕生的新興學(xué)科，脂類代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的重要分支，用以描繪機體特定狀態(tài)下脂類代謝的整體輪廓。肝臟是人體最大的代謝器官，在脂類化合物的消化、吸收、合成、分解、運輸過程中發(fā)揮著重要作用，通過對脂類代謝輪廓的描述可以反映肝臟所處的病理生理狀態(tài)。而通過前期研究發(fā)現(xiàn)，以文獻報道的肝損傷劑量（300 mg/kg）[5]給小鼠使用APAP后1 h可發(fā)現(xiàn)肝中還原型谷胱甘肽（GSH）水平顯著降低，說明在該觀察點APAP肝損傷已經(jīng)啟動。鑒于此，本研究以文獻報道的肝損傷劑量腹腔注射給予小鼠APAP，并用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLCTriple-TOF-MS）研究APAP給藥1 h后小鼠血漿中脂類代謝組學(xué)的改變情況，以期發(fā)現(xiàn)與APAP導(dǎo)致急性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)的差異代謝物，為肝損傷的機制研究及發(fā)現(xiàn)早期肝損傷潛在生物標(biāo)志物提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

5600 UPLC-Triple-TOF-MS系統(tǒng)（美國AB Sciex公司）；EG1150石蠟包埋機、RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號：S31044，純度：99%）；甲醇、甲酸為質(zhì)譜純，均購自美國Fisher Chemical公司。

1.3 動物

SPF級BALB/c小鼠20只，♂，18～22 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）-2014-0011。

2 方法

2.1 分組與給藥

小鼠于遵義基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室SPF級動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組和APAP肝損傷組。APAP肝損傷組小鼠于4：00 p.m.－5：00 p.m.一次性腹腔注射APAP（300 mg/kg），正常組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。

2.2 血樣采集及處理

小鼠均于腹腔注射后1 h取血，將血樣置于肝素抗凝管中，立即緩慢搖勻，靜置1 h，然后以3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得小鼠血漿。

2.3 UPLC-Triple-TOF-MS法檢測小鼠血漿中代謝產(chǎn)物

2.3.1 色譜條件色譜柱為BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈-異丙醇（1∶1，V/V）溶液（含0.1%甲酸），梯度洗脫；流速為0.4 mL/min；進樣量為20 μL，柱溫為40℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.3.2 質(zhì)譜條件 樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正、負離子掃描模式，電噴霧離子源（ESI），電噴霧毛細管電壓、進樣電壓和碰撞電壓分別為1.0 kV、40 V和6 eV，離子源溫度和去溶劑溫度分別為120、500℃，載氣流量為900 L/h，質(zhì)譜掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）50～1 000，分辨率為30 000。

2.3.3 樣品制備與檢測 取小鼠血漿樣品100 μL，加入400 μL甲醇-乙腈（1∶1，V/V）溶液，混勻，冰上超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）萃取2次，每次15 min；然后將樣品置于－20℃條件下靜置30 min，再在4℃條件下以13 000×g離心15 min，取上清液，抽干；用乙腈-水（1∶1，V/V）溶液復(fù)溶至100 μL，備用。按“2.3.1”“2.3.2”項下條件進樣分析。

2.4 數(shù)據(jù)采集與分析

2.4.1 代謝物的搜庫鑒定 質(zhì)譜數(shù)據(jù)用代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI V2.4進行搜庫鑒定，將MS和MS/MS信息，包括代謝物的精確分子量、保留時間等與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配。主要鑒定數(shù)據(jù)庫為人類代謝組數(shù)據(jù)庫（The human metabolome database，HMDB），Metlin代謝組數(shù)據(jù)庫（Metlin metabolite database，簡稱“Metlin”）以及脂類圖譜數(shù)據(jù)庫（LIPID MAPS databases）。

2.4.2 主成分分析（PCA） 質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件progenesis QI V2.4進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化處理后，最終得到一個保留時間、m/z和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣。將歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+14.0進行分析。采用無監(jiān)督的PCA來觀察各樣本之間的總體分布和整體分析過程的穩(wěn)定性，模型參數(shù)R2X表示所有主成分對變量的累積解釋率，數(shù)值越接近1說明模型擬合準(zhǔn)確性越好。

2.4.3 偏最小二乘法分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA） 用有監(jiān)督的PLS-DA及OPLS-DA來區(qū)分各組間代謝輪廓的整體差異。PLS-DA是一種有監(jiān)督的分析方法，把各組分門別類，有利于發(fā)現(xiàn)組間的異同點。OPLS-DA是PLS-DA的衍生算法，進一步對不相關(guān)數(shù)據(jù)進行排除，可以更好地區(qū)分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。評價模型的參數(shù)有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測能力，這3個指標(biāo)越接近于1時表示模型越穩(wěn)定可靠，一般Q2＞0.5表示模型的預(yù)測能力較好。

2.4.4 脂類差異代謝物的分析 篩選OPLS-DA結(jié)果中變量重要性投影（Variable influence in the projection，VIP）＞1和studentt檢驗中P＜0.05的脂類代謝物為兩組比較的脂類差異代謝物[7]，差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）＝正常組差異代謝物峰強度/APAP肝損傷組差異代謝物峰強度。根據(jù)該化合物的色譜響應(yīng)強度（峰高、峰面積），對脂類差異代謝物和APAP進行相對定量分析[7]。并使用R語言，將所得脂類差異代謝物與APAP水平進行相關(guān)性分析，得到相關(guān)性系數(shù)r和P值，P＜0.05認為該脂類差異代謝物與APAP的水平顯著相關(guān)。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Triple-TOF-MS譜圖分析結(jié)果

在該檢測條件下，代謝物分離情況良好，兩種離子檢測模式具有很好的互補性，各成分的保留時間均在15 min以內(nèi)，正常組和APAP肝損傷組樣品總離子流圖有一定區(qū)別?？傠x子流圖見圖1。

圖1 總離子流圖Fig 1 TIC diagrams

3.2 PCA分析結(jié)果

本模型擬合參數(shù)R2X為0.787，說明建模理想。從PCA分析的散點圖中可以看出，正常組和APAP肝損傷組的樣品點分布在圖中不同的象限，說明正常組和APAP肝損傷組小鼠血漿中整體代謝輪廓有很好的區(qū)分。結(jié)果見圖2。

圖2PCA分析圖Fig 2 Plot of PCAanalysis

3.3 PLS-DA、OPLS-DA分析結(jié)果

在本研究的分析過程中，選擇3個主成分作為最終建模所需數(shù)目，對應(yīng)的R2Y和Q2數(shù)據(jù)如下：在PLS-DA分析中R2X＝0.753，R2Y＝0.987，Q2＝0.879；在OPLS-DA分析中R2X＝0.753，R2Y＝0.987，Q2＝0.905，說明建模情況良好。從兩種分析圖中可以看出，正常組和APAP肝損傷組各個樣品點分布于圖形不同的區(qū)域，具有良好的區(qū)分度，說明正常組和APAP肝損傷組小鼠血漿中整體代謝輪廓存在明顯差異。PLS-DA和OPLS-DA分析圖見圖3。

3.4 脂類差異代謝物分析結(jié)果

APAP肝損傷組與正常組比較，共發(fā)現(xiàn)14個脂類差異代謝物，包括脂肪酰類（5個）、甘油磷脂類（8個）、鞘脂類化合物（1個）。且與正常組比較，APAP肝損傷組小鼠血漿中8個甘油磷脂類化合物和5，8，12-三羥基-9-十八碳烯酸、9-硫雜硬脂酸（脂肪酰類）水平顯著降低（P＜0.05），9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸、十四烷二酸、L-肉豆蔻酰基肉堿（脂肪酰類）和Scyphostatin A（鞘脂類）水平顯著升高（P＜0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，與血漿APAP水平[強度為（4.155±3.978）]顯著相關(guān)的脂類差異代謝物5個，分別為9-硫雜硬脂酸、十四烷二酸、9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸、Scyphostatin A、L-肉豆蔻?；鈮A（r分別為－0.708、0.579、0.612、0.736、0.928，P均＜0.05）。脂類差異代謝物鑒定信息見表1，脂類差異代謝物的相對表達結(jié)果見表2。

圖3PLS-DA和OPLS-DA分析圖Fig 3 Plots of PLS-DAand OPLS-DAanalysis

表1 脂類差異代謝物鑒定信息Tab 1 Lipid differential metabolites identification

4 討論

APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是常用的藥物性肝損傷模型，以過量APAP造模16 h后可出現(xiàn)明顯的ALT含量顯著升高，以及肝臟病理損傷[8]。課題前期對過量APAP造模后1 h的時間點進行了研究，此時ALT含量并未升高，也未出現(xiàn)明顯的病理改變，但肝組織中GSH含量顯著下降，而GSH是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，也是APAP毒性代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵解毒物質(zhì)。該結(jié)果說明，APAP造模后1 h機體抗氧化能力顯著下降，APAP肝毒性已經(jīng)啟動。在肝毒性的啟動階段，機體勢必通過發(fā)生一系列的變化逐步加重肝損傷。通過系統(tǒng)生物學(xué)手段可以揭示機體發(fā)生在組織改變之前的整體變化，是目前快速尋找生物標(biāo)志物的常用手段[9]。目前，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，Thulin P等[10]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)氨酶升高之前，角蛋白18（K18）已經(jīng)開始明顯上升，較ALT對肝損傷更為敏感。Antoine DJ等[11]發(fā)現(xiàn)高速泳動族蛋白1（HMG1）也可在轉(zhuǎn)氨酶升高之前明顯升高。此類生物標(biāo)志物與傳統(tǒng)肝損傷標(biāo)志物ALT相比，具有更快速、更敏感的特點，為DILI的早期診斷提供了新的可能。在代謝組學(xué)方面同樣有研究發(fā)現(xiàn)，DILI早期可出現(xiàn)明顯的代謝輪廓的改變，血漿的內(nèi)源性代謝物會比血清生化參數(shù)對DILI的反應(yīng)更為敏感[12]。肝臟是人體最大的代謝器官，參與大部分內(nèi)、外源性物質(zhì)的代謝，也是脂類代謝的主要場所，有研究認為脂質(zhì)過氧化過程是導(dǎo)致DILI的重要原因之一[13]。本研究主要從脂類代謝的角度觀察機體在給予肝損傷劑量APAP之后的變化。本研究以APAP造模后1 h這個時間點，觀察小鼠血漿脂類代謝物的改變情況，以期發(fā)現(xiàn)與APAP造模相關(guān)的脂類差異代謝物，說明肝損傷的發(fā)生過程，并尋找有進一步研究價值的生物標(biāo)志物，這可為藥物性肝損傷的早期診療提供一定的理論幫助。

表2 脂類差異代謝物的相對表達結(jié)果Tab 2 Relative expression results of lipid different metabolites

本研究發(fā)現(xiàn)，正常組和APAP肝損傷組小鼠血漿代謝組的整體輪廓存在明顯差異，具有很好的區(qū)分度。共檢出了14個脂類差異代謝物，包括脂肪酰類、甘油磷脂類和鞘脂類。脂肪酰類包括5個差異代謝物。其中，9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸是一種亞油酸氧化產(chǎn)物，部分亞油酸可由脂氧合酶、環(huán)氧酶、P450酶催化或者通過非酶促作用發(fā)生氧化反應(yīng)。在針對非酒精性脂肪肝炎患者的血清脂類質(zhì)譜分析中發(fā)現(xiàn)，亞油酸氧化產(chǎn)物與肝組織病理（炎癥、纖維化、脂肪變性）密切相關(guān)。非酒精性脂肪肝炎患者亞油酸氧化產(chǎn)物較肝脂肪變性患者明顯增多[14]。亞油酸氧化產(chǎn)物可增強肝臟Kupffer細胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達促進炎癥反應(yīng)[15]。同時也可以增加過氧化物水平誘導(dǎo)肝細胞凋亡[16]。在本研究中，肝損傷劑量APAP給藥1 h后小鼠血漿中9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸水平明顯升高，這很可能是肝臟損傷的不利信號。十四烷二酸是一種C14α，ω-二羧酸，也是一種重要的脂肪酸氧化產(chǎn)物。在肝臟微粒體，脂肪酸的ω碳原子羥化生成ω-羧脂肪酸，再進一步生成α，ω-二羧酸，隨后進入線粒體發(fā)生β-氧化。同時二羧酸也是過氧化物酶體增殖劑激活受體的配體（PPARα），參與調(diào)解肝內(nèi)的脂肪代謝過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在急性酒精性肝炎的患者血清中，二羧酸包括十四烷二酸水平顯著升高[17]。在本研究中，過量APAP給藥后1 h，可以發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中十四烷二酸水平顯著升高。

在14個脂類差異代謝物中，8個屬于甘油磷脂類。肝臟是血液中甘油磷脂的主要來源，甘油磷脂同樣是肝細胞以及線粒體膜的重要組成部分，PE（20∶3（8Z，11Z，14Z）/0 ∶0）、LysoPE（20 ∶4（8Z，11Z，14Z，17Z）/0 ∶0）、LysoPE（20 ∶3（5Z，8Z，11Z）/0 ∶0）、PE（20 ∶5（5Z，8Z，11Z，14Z，17Z）/0 ∶0）、PE（18 ∶1（9Z）/0 ∶0）、LysoPE（18 ∶2（9Z，12Z）/0∶0）、PE（22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）/0∶0）屬于溶血磷脂酰乙醇胺或溶血磷脂，通常由磷脂酶A催化降解磷脂得到，也可來源于甘油一酯的磷酸化作用或者甘油磷脂的?；饔?。在不同的肝臟疾病中，溶血磷脂的變化并不一致。例如，與肝硬化患者相比，LysoPEs在肝癌細胞中表達明顯增多[18]。在自身免疫性肝炎的早期研究中顯示，刀豆球蛋白A處理的小鼠LysoPEs明顯下調(diào)[19]，在本研究中，在APAP給藥1 h后，小鼠血漿中溶血磷脂水平與正常組比較明顯下降，與上述文獻報道結(jié)果一致。PS（MonoMe（11，5）/DiMe（13，5））是一種磷脂酰絲氨酸，也是細胞膜的重要組成成分。APAP處理1 h時，小鼠血漿中 PS（MonoMe（11，5）/DiMe（13，5））水平同樣明顯降低。膜磷脂水平降低，很可能反映了過量APAP對細胞膜或線粒體膜造成了影響。

將脂類差異代謝物水平與血漿中APAP水平進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，9-硫雜硬脂酸、十四烷二酸、9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸、Scyphostatin A和L-肉豆蔻?；鈮A均與APAP水平顯著相關(guān)。

綜上所述，本研究探討了APAP肝損傷造模后1 h，轉(zhuǎn)氨酶和組織損傷尚未出現(xiàn)之前血漿脂類代謝組學(xué)的變化，篩選與早期肝損傷相關(guān)的脂類差異代謝物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個溶血磷脂水平下降，反映了肝損傷劑量APAP對細胞膜結(jié)構(gòu)和功能可能有影響；同時發(fā)現(xiàn)，APAP致肝損傷后，小鼠血漿中十四烷二酸、9-過氧化氫-10，12-十八碳二烯酸水平明顯升高，且與APAP水平顯著相關(guān)。該結(jié)果可為進一步的DILI機制研究及生物標(biāo)志物研究提供理論支持。