正交試驗法優(yōu)化加楊樹皮中白楊素的純化工藝

印 敏，嚴 奇，趙友誼，王 鳴，徐 曙，廖盼華，王奇志*

(1. 江蘇省中國科學院植物研究所 江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室，江蘇 南京210014；2. 江蘇省中國科學院植物研究所 江蘇省農(nóng)業(yè)種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京210014)

加拿大楊(PopuluscanadensisMoench)，又名加楊，是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)多年生落葉大喬木，主根和側根發(fā)達，樹干通直挺拔，枝葉茂密；其品種生長快，適應性強，是速生用材林、防護林和行道河渠綠化的好樹種，廣泛應用于城鄉(xiāng)綠化[1]。此外，加拿大楊還含有大量酚酸類化合物，如白楊素、高良姜素-3-甲氧基、喬松素、槲皮素-3,7-二甲氧基、鼠李素、山柰酚-3-甲氧基、芹菜素等[2]，具有鎮(zhèn)痛、抗自由基、抗腫瘤等藥理作用，能保護心腦缺血損傷和肝損傷，對生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有作用[3-4]。其中，白楊素的作用尤為顯著，能夠抗炎，抗抑郁，抑制腫瘤細胞，調節(jié)免疫反應,修復睪丸損傷等[5-9]，也是合成抗菌、抗癌、降血糖、調節(jié)免疫等藥物的原料[10-13]。

根據(jù)文獻報道，白楊素的分離純化工藝主要是，以乙醇-水系統(tǒng)為洗脫劑，利用大孔樹脂柱層析，進行梯度洗脫，收集洗脫液，重結晶得到白楊素粗品[14-15]。然而，由于大孔樹脂的有機物殘留高，對酚酸類化合物的純化效果不及聚酰胺。因此，開發(fā)簡便、準確、有效的從經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹皮總酚酸流浸膏中提純白楊素的制備方法具有重要意義。本實驗以白楊素的純度為指標，采用正交試驗法優(yōu)化聚酰胺純化白楊素的工藝，為加拿大楊資源的進一步開發(fā)利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國Aglient 公司，Aglient 1110 HPLC)；R-210型旋轉蒸發(fā)器(瑞士Buchi公司)；LIBROR AEL-200型電子天平；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋。

1.1.2 試劑

加拿大楊樹皮由江蘇泗陽昇茂木業(yè)有限公司提供，經(jīng)江蘇省中國科學院植物研究所袁昌齊研究員鑒定為加拿大楊，標本現(xiàn)存放于江蘇省中國科學院植物研究所藥用植物研究開發(fā)中心(標本編號：Pc20170919)。白楊素對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號：111701-200501)；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；聚酰胺(上海源葉生物公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 楊樹皮總酚酸的提取

稱取經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹皮15 kg，用60%乙醇，總液料比10∶1 (mL·g-1)，回流提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，濃縮得總酚酸流浸膏2.5 kg。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取白楊素對照品5.01 mg，置50 mL棕色量瓶中，加60%乙醇溶解并定容，得白楊素貯備液(0.1002 mg·mL-1)；精密量取白楊素貯備液適量，用60%乙醇配制成系列濃度的對照品溶液，即得。

1.2.3 樣品的測定

精密吸取正交試驗樣品1 mL，過濾，取濾液，即得供試品溶液。通過高效液相色譜法，計算白楊素的純度。

2 結果與分析

2.1 聚酰胺對總酚酸中白楊素的靜態(tài)吸附-洗脫性能實驗

取3種不同型號的聚酰胺(30-60目、60-80目、100-200目)，加入已測含量的總酚酸提取液，靜置、吸附、過濾、濾液定容、得未吸附溶液。過濾的聚酰胺用80%的乙醇洗脫至無色、定容得洗脫液。另外聚酰胺烘干，稱重，計算平均重量。通過高效液相色譜測定各溶液中白楊素的含量。最終得出60-80目聚酰胺對總酚酸中白楊素的靜態(tài)吸附量為30-60目聚酰胺的3倍(體積比)，靜態(tài)洗脫量為100-200目聚酰胺的7倍(體積比)，吸附率為99%，洗脫率98%。

2.2 聚酰胺柱解吸附影響因素的考察

預裝60-80目聚酰胺柱6 根，將等量總酚酸提取液吸附上樣，依次用水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液各3個柱體積洗脫，收集洗脫液，檢測各溶液中白楊素的濃度，選擇最佳洗脫溶劑。通過高效液相色譜法測定各溶液中白楊素的含量。結果表明，60%乙醇溶液是最佳洗脫溶劑，此部位白楊素含量較高。

2.3 單因素試驗

2.3.1 上樣濃度的篩選

預裝60-80目聚酰胺柱5 根，將等量不同濃度的總酚酸提取液(上樣濃度：總酚酸流浸膏的稀釋倍數(shù)，分別稀釋1、2、3、4、5倍)吸附上樣，以60%乙醇溶液為流動相，洗脫3個柱體積，收集洗脫液，經(jīng)重結晶得白楊素粗品，按照“1.2.3項”方法進行純度測定。結果顯示，在一定范圍內，白楊素純度與稀釋倍數(shù)呈正相關；當稀釋倍數(shù)為3時，白楊素純度與上樣濃度無關，幾乎為一定值。從白楊素工藝生產(chǎn)的角度考慮，故選擇稀釋倍數(shù)為3，見表1。

表1 上樣濃度的篩選

2.3.2 上樣量的篩選

預裝60-80 目聚酰胺柱5 根，將不同量已稀釋3 倍的總酚酸提取液(上樣量：上樣樣品與聚酰胺柱的體積比，分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8)吸附上樣，以60%乙醇溶液為流動相，洗脫3個柱體積，收集洗脫液，經(jīng)重結晶得白楊素粗品，按照“1.2.3項”方法進行純度測定。結果顯示，在一定范圍內，白楊素純度與上樣量呈負相關；當上樣量達到1∶2時，白楊素純度與上樣量無關，幾乎為一定值。從白楊素工藝生產(chǎn)的角度考慮，故選擇上樣量為聚酰胺柱體積的1/2，見表2。

表2 上樣量的篩選

2.3.3 吸附流速的篩選

預裝60-80目聚酰胺柱6根，量取聚酰胺柱體積1/2的已稀釋3倍的總酚酸提取液，分別以5、10、20、40、60、100 ml/min的流速吸附上樣，以60%乙醇溶液為流動相，洗脫3個柱體積，收集洗脫液，經(jīng)重結晶得白楊素粗品，按照“1.2.3項”方法進行純度測定。結果顯示，在一定范圍內，白楊素純度與吸附流速無關；當吸附流速達到20 ml/min時，白楊素純度與吸附流速呈負相關。從白楊素工業(yè)生產(chǎn)效率的效率考慮，故選擇吸附流速為20 ml/min，見表3。

表3 吸附流速的篩選

2.3.4 洗脫流速的篩選

預裝60-80目聚酰胺柱6根，量取聚酰胺柱體積1/2的已稀釋3倍的總酚酸提取液，以40 ml/min的流速吸附上樣，以60%乙醇溶液為流動相，分別以10、20、40、80、120、160 ml/min的流速洗脫3個柱體積，收集洗脫液，經(jīng)重結晶得白楊素粗品，按照“1.2.3項”方法進行純度測定。結果顯示，在一定范圍內，白楊素純度與洗脫流速無關；當洗脫流速達到80 ml/min時，白楊素純度與洗脫流速呈負相關。從白楊素工業(yè)生產(chǎn)的效率考慮，故選擇洗脫流速為80 ml/min，見表4。

表4 洗脫流速的篩選

2.4 正交試驗設計

為探究聚酰胺柱層析純化總酚酸溶液中白楊素的最佳工藝條件，對影響分離效果的主要因素設計了4因素3水平的L9(34)正交試驗方案，經(jīng)重結晶得白楊素粗品，以白楊素純度為考察指標，選擇最佳上樣濃度(上樣濃度：總酚酸流浸膏的稀釋倍數(shù))、上樣量(上樣量：上樣樣品與聚酰胺柱的體積比)及流速(單位：ml/min)。正交試驗因素與水平見表5、試驗結果見表6、方差分析結果見表7。

表5 正交實驗設計

2.5 正交樣品溶液的制備

分別稱取楊樹皮總酚酸流浸膏2.5 kg，按照L9(34)正交試驗表上樣、過柱。

2.6 正交試驗方法及結果

用L9(34)正交試驗表進行正交試驗研究，試驗結果見表6，并對白楊素純度進行方差分析，結果見表7。

表6 正交試驗結果及分析

表7 方差分析結果

由表7能夠直觀地看出，以白楊素純度為考察指標，影響純度的因素依次為A>D>B>C，即上樣濃度(總酚酸流浸膏稀釋倍數(shù))的影響最高，其余依次是洗脫流速、上樣量(上樣樣品與聚酰胺的體積比)，影響最小的是吸附流速。根據(jù)方差分析結果可知，A因素對白楊素純度的影響有顯著性差異，B和D因素對白楊素純度的影響無顯著性差異。根據(jù)表6各因素k的變化，A3>A2>A1，B2>B1>B3，C1>C3>C2，D2>D3>D1，得出A因素應選擇水平3，B和D因素應選擇水平2，C因素應選擇水平1，即A3B2C1D2。最終確定最佳的聚酰胺純化工藝條件為：A3B2C1D2，即上樣濃度為稀釋3倍的楊樹皮總酚酸流浸膏，上樣量與聚酰胺柱的體積比為1∶2，吸附流速為20 ml/min，洗脫流速為80 ml/min。

2.7 最佳純化工藝條件的驗證

按照上述最佳的聚酰胺純化工藝進行3次驗證試驗，其結果見表8。由驗證結果可知，按最佳的聚酰胺純化工藝得到的白楊素純度均高于其它各正交試驗值，三份樣品白楊素的平均提取率為88.34%，RSD為0.44%。說明該工藝穩(wěn)定、可靠，達到了純化條件優(yōu)化的目的。

表8 驗證試驗結果

3 結論

3.1 本試驗使用高效液相色譜法，對白楊素對照品溶液及供試品溶液進行檢測，直接測定供試品溶液中白楊素的純度，操作簡單，干擾少，測定結果更準確。

3.2 白楊素是加拿大楊樹皮中總酚酸的主要成分之一，本實驗以白楊素純度為考察指標，采用了L9(34) 正交試驗，確定了最佳的純化工藝條件為：以60-80目的聚酰胺聚酰胺裝柱，以60%乙醇溶液為流動相，上樣濃度為稀釋3倍的經(jīng)石油醚脫脂后的楊樹皮總酚酸流浸膏，上樣量與聚酰胺柱的體積比為1∶2，吸附流速為20 ml/min，洗脫流速為80 ml/min。收集60%乙醇溶液洗脫部位，此部位白楊素含量較高，經(jīng)重結晶可得白楊素粗品。該提取工藝穩(wěn)定可行，適用于白楊素的工業(yè)化生產(chǎn)。