乳積方抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231及MCF-7體外增殖的研究

李宏良，田華琴，梁貴文，陳學(xué)彰，王斌，楊耀林，黃泳立，朱志霞，陳錫康

廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬佛山中醫(yī)院腫瘤中心，廣東 佛山 528000

乳積方是佛山市中醫(yī)院腫瘤中心用以防治乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的經(jīng)驗(yàn)方。前期研究發(fā)現(xiàn)乳積方對(duì)乳腺癌化療后的患者具有增效減毒及提高機(jī)體免疫功能的作用，并可改善乳腺癌術(shù)后患者的無(wú)疾病生存時(shí)間及生活質(zhì)量[1-3]。為進(jìn)一步分析乳積方對(duì)不同類型乳腺癌的影響，本研究選取乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231及MCF-7進(jìn)行了以下體外試驗(yàn)。

1 材料

1.1 藥物及試劑乳積方由柴胡、白芍、黨參、八月札、瓜蔞皮、浙貝、穿山甲、海藻等組成，購(gòu)自廣州至信藥業(yè)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品。四氮唑藍(lán)（MTT）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人乳腺正常細(xì)胞MCF-10A由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院提供。

1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱（一恒BPN-80CH），離心機(jī)（中科中佳 SC-3612），超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO），倒置熒光顯微鏡（奧特光學(xué)BDS400），自動(dòng)酶標(biāo)儀（ThermosMultiskan FC），電子天平（奧豪斯儀器有限公司CP-214）。

2 方法

2.1 藥物的制備乳積方由柴胡10 g、白芍15 g、黨參15 g、八月札15 g、瓜蔞皮15 g、浙貝10 g、穿山甲10 g、海藻15 g等組成，藥材經(jīng)品種鑒定后用文火煎煮兩次，合并藥液，過(guò)濾，棄去藥渣，將濾液煎煮濃縮至每1 ml含生藥2 g。取適量藥液用無(wú)菌水將乳積方配制成2 mg/mL的濃度，以0.22 μm孔徑微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾除菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人乳腺正常細(xì)胞MCF-10A三種細(xì)胞株在37℃，5%CO2飽和濕度條件下，用含有鏈霉素（50 units/mL），青霉素（100 units/mL）、胎牛血清（10%）等試劑的培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)達(dá)到培養(yǎng)瓶80%空間密度按照常規(guī)的細(xì)胞傳代方法傳代。

2.3 分組及乳積方藥物處理細(xì)胞以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為觀察組，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，按照2.0×104細(xì)胞/孔接種于96孔板。在5%CO2和37℃下培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞單層鋪滿96孔板底，加入不同濃度梯度（0.2 g/ml，0.1 g/ml，0.05 g/ml，0.025 g/ml，0.0125 g/ml，0.006 25 g/ml）的乳積方藥液，每孔100 μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2飽和濕度條件下處理72 h。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化且拍照。同時(shí)設(shè)不加乳積方藥液常規(guī)培養(yǎng)為空白對(duì)照、人乳腺正常細(xì)胞MCF-10A為陰性對(duì)照。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)取待測(cè)細(xì)胞，于培養(yǎng)體系內(nèi)加入5 mg/mL MTT液20 ul，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入每孔150 ul二甲基亞砜（DMSO），微量振蕩器振蕩10 min。選擇570 nm波長(zhǎng)，在自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔光吸收值（OD值）。

2.5 數(shù)據(jù)分析

2.5.1 細(xì)胞存活率的計(jì)算 每個(gè)MTT實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。以每種細(xì)胞未經(jīng)過(guò)乳積方藥物處理的細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)值為細(xì)胞正常值。細(xì)胞存活率（%）=（不同濃度乳積方處理后的細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)OD值/細(xì)胞正常OD值）×100%。每種細(xì)胞獲得6個(gè)濃度下的存活率數(shù)據(jù)。

2.5.2 半數(shù)抑制率（IC50）的計(jì)算 對(duì)于每種細(xì)胞來(lái)說(shuō)，使用以上6個(gè)濃度的細(xì)胞存活率做線性回歸曲線，在細(xì)胞存活率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的藥物的濃度為IC50值（IC50的數(shù)值越小，說(shuō)明藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的效果越強(qiáng)）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用線性回歸處理，求得IC50。

3 結(jié)果

3.1 乳積方對(duì)人乳腺正常細(xì)胞MCF-10A體外增殖的影響

人乳腺正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中加入不同濃度的乳積方，獲得的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。使用藥物濃度與細(xì)胞存活率做擬合曲線，得到方程式：y=0.015 01x-0.8143（3R2=0.873）。獲得IC50y=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的x=0.013 498；即細(xì)胞存活率為50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的藥物濃度為0.013 g/ml。

3.2 乳積方對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231體外增殖的影響

圖1 乳積方處理MCF-10A細(xì)胞72 h細(xì)胞倒置顯微鏡拍照

表1 6個(gè)濃度下的人乳腺正常細(xì)胞MCF-10A存活率

圖2 6個(gè)濃度乳積方處理下MCF-10A細(xì)胞存活率擬合曲線

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在體外培養(yǎng)過(guò)程中加入不同濃度的乳積方，獲得的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。使用藥物濃度與細(xì)胞存活率做擬合曲線，得到方程式：y=-0.308 62 ln 4.449 09x（R2=0.897 13）。獲得IC50y=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的x=0.044 476；即細(xì)胞存活率為50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的藥物濃度為0.044 g/ml。

3.3 乳積方對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7體外增殖的影響

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7在體外培養(yǎng)過(guò)程中加入不同濃度的乳積方，獲得的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。使用藥物濃度與細(xì)胞存活率做擬合曲線，得到方程式：y=-0.351 51 ln 4.357 06x（R2=0.944 23）。獲得IC50y=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的x=0.055 342；即細(xì)胞存活率為50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的藥物濃度為0.055 g/ml。

圖3 乳積方處理MDA-MB-231細(xì)胞72 h細(xì)胞倒置顯微鏡拍照

4 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，2017年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)分析，美國(guó)新發(fā)乳腺癌病例和死亡病例分別達(dá)到255 180例和41 070例[5]。在中國(guó)，新發(fā)的乳腺癌病例和死亡病例也分別高達(dá)272 400例和70 700例，并呈持續(xù)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[6]。雖然手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療以及新興靶向治療已取得很大成效，但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是乳腺癌治療失敗的重要原因。

乳積方由柴胡、白芍、黨參、八月札、瓜蔞皮、浙貝、穿山甲、海藻等組成。藥理研究顯示，乳積方中的柴胡富含柴胡多糖，可使細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)、自然殺傷細(xì)胞功能增強(qiáng)，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)核率[7]，對(duì)于乳腺癌具有抑瘤轉(zhuǎn)移作用；浙貝有效成分貝母堿，具有抗腫瘤并能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[8]；穿山甲能夠治療乳腺疾病、瘰疬、腫瘤等疾病[9]；黨參含多種糖類、酚類、甾醇、揮發(fā)油、黃芩素葡萄糖甙、皂甙及微量生物堿，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗癌等多種生理活性[10]。對(duì)化療放療引起的白細(xì)胞下降有提升作用；山慈菇含有秋水仙堿等多種生物堿[11]，可提高癌細(xì)胞中的cAMP水平，抑制癌細(xì)胞有絲分裂和癌細(xì)胞的增殖[12]，但本品有毒，過(guò)量可致胃腸道不適，多發(fā)性神經(jīng)炎，白細(xì)胞減少，中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，甚至死亡。海藻所含的海藻多糖直接作用于腫瘤細(xì)胞，能夠激活人體免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]。

表2 6個(gè)濃度下的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231存活率

圖4 6個(gè)濃度乳積方處理下MDA-MB-231細(xì)胞存活率擬合曲線

圖5 乳積方處理MCF-7細(xì)胞72 h細(xì)胞倒置顯微鏡拍照

表3 6個(gè)濃度下的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7存活率

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)乳積方聯(lián)合化療治療乳腺癌具有增效減毒及提高機(jī)體免疫功能的作用，治療后無(wú)明顯骨髓抑制，同時(shí)腫瘤相關(guān)抗原CA153下降、反映細(xì)胞免疫功能的CD3+/HLA-DR+（活化T淋巴細(xì)胞）等指標(biāo)呈明顯升高趨勢(shì)[1]。2013年在乳積方對(duì)女性乳腺癌術(shù)后患者生存狀況的影響研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用乳積方可以明顯有效的預(yù)防乳腺癌術(shù)后患者的疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，提高生活質(zhì)量[2-3]。隨后還發(fā)現(xiàn)乳積方辨證加減對(duì)于激素受體陰性、術(shù)后、女性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者在治療結(jié)束2年內(nèi)具有一定的改善無(wú)疾病生存的作用，對(duì)于預(yù)防激素受體陰性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌尤其是三陰性乳腺癌術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有一定的應(yīng)用價(jià)值[4]。

圖6 6個(gè)濃度乳積方處理下MCF-7細(xì)胞存活率擬合曲線

MCF-10A細(xì)胞株來(lái)源于人乳腺正常細(xì)胞，屬非致瘤的上皮細(xì)胞株。乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231因其ER、PR及HER-2均為陰性歸于三陰性的乳腺癌細(xì)胞株，分子分型為基底細(xì)胞樣型；而MCF-7細(xì)胞株的ER、PR陽(yáng)性、HER-2陰性歸于腔上皮型[14]。本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度的乳積 方（0.2 g/ml，0.1 g/ml，0.05 g/ml，0.025 g/ml，0.012 5 g/ml，0.006 25 g/ml）作用 72 h 后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。倒置顯微鏡拍照所示，不同濃度處理后的乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞增殖受到了不同程度的抑制。將人乳腺正常細(xì)胞MCF-10A及人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7三組細(xì)胞的藥物濃度與細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)做散點(diǎn)圖并用趨勢(shì)線擬合分別得到方程y=0.01501x-0.81433（R2=0.87303），y=-0.308 62 ln 4.449 09x（R2=0.897 13），y=-0.351 51 ln 4.357 06x（R2=0.944 23），其中x代表藥物濃度，y代表細(xì)胞存活率。計(jì)算細(xì)胞IC50值時(shí)，三種模型對(duì)應(yīng)的藥物濃度依次是 0.013 g/ml，0.044 g/ml，0.055 g/ml。其中0.1 g/ml乳積方作用下，MCF-7細(xì)胞存活率已經(jīng)降低到50%以下；而0.044 g/ml乳積方作用下，MDA-MB-231細(xì)胞存活率低于50%。提示乳積方制劑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有更顯著的細(xì)胞增殖抑制作用。

本研究也發(fā)現(xiàn)，乳積方對(duì)人乳腺正常細(xì)胞MCF-10A也存在抑制作用，而在臨床研究中并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的不良反應(yīng)[1-4]。其原因可能是乳積方中的山慈菇有一定毒性，在體外對(duì)正常細(xì)胞存在細(xì)胞毒作用，但口服中藥需經(jīng)過(guò)胃腸道消化吸收、肝臟代謝，體外試驗(yàn)并不能模擬人體對(duì)藥物的消化吸收及代謝等效應(yīng)。同時(shí)，癌細(xì)胞的增殖能力明顯強(qiáng)于正常人體細(xì)胞，在體外實(shí)驗(yàn)中明顯看到腫瘤細(xì)胞株具有更高存活率，正常人體細(xì)胞體外培養(yǎng)相對(duì)較難。本研究中MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值低于MCF-7細(xì)胞，說(shuō)明乳積方制劑對(duì)不同的乳腺細(xì)胞作用效應(yīng)有所差異，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有更顯著的細(xì)胞增殖抑制作用，或提示乳積方對(duì)三陰性乳腺癌的某些類型更具應(yīng)用價(jià)值。