肺癌脾虛痰濕證患者血清標(biāo)志物的蛋白組學(xué)研究

唐瑩，周瑞生，黃海福，周岱翰

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000；

1 研究背景

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，亦是癌癥患者死亡的首因[1，2]。盡管治療肺癌的方法包括手術(shù)切除，放射治療，化療和靶向治療正在進(jìn)行中，5年肺癌的存活率仍處于較低水平[3]。各種生物標(biāo)志物已在運用于肺癌的評估[4，5]。然而，很少有標(biāo)記物被批準(zhǔn)用于臨床。因此，目前迫切需要尋找新的臨床生物標(biāo)志物來評估肺癌。

近年來，中藥治療肺癌取得了顯著的療效，抗腫瘤中成藥毒副作用少、臨床應(yīng)用廣、提高免疫能力明顯，減少并發(fā)癥，延長患者生命，甚至可以使患者實現(xiàn)“帶瘤生存”的狀態(tài)，中藥在抗腫瘤用藥治療中占有重要地位。肺癌病機為本虛標(biāo)實，與“虛、毒、痰、瘀”有關(guān)。本虛主要指肺虛、脾虛，日久傷腎，標(biāo)實則痰、瘀作祟。中醫(yī)認(rèn)為脾胃為后天之本，李中梓提出“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”，按照五行相生理論，肺屬金，脾屬土，土生金，補脾土即生肺金。肺癌多因痰濕作祟，痰濕阻礙氣機，進(jìn)而產(chǎn)生瘀血，因此健脾除痰是中醫(yī)治療肺癌的常用治法之一[6，7]。周岱翰等[8]將肺癌分為按肺郁痰瘀、脾虛痰濕、陰虛痰熱、氣陰兩虛4型。劉嘉湘等[9]將肺癌分為氣陰兩虛、陰虛內(nèi)熱、脾虛痰濕、陰陽兩虛及氣滯血瘀5型。王少墨等[10]對國內(nèi)公開發(fā)表的67篇中醫(yī)藥治療原發(fā)支氣管肺癌的臨床報道進(jìn)行了用藥頻次的統(tǒng)計分析結(jié)果表明：中醫(yī)藥治療肺癌中，使用補氣10味，使用率83%，使用化痰藥15味，使用率66%；健脾化痰藥使用頻率較高，其中半夏、茯苓、白術(shù)、薏苡仁、陳皮、貝母和黨參等健脾藥及理氣藥的使用頻率分別為100%、100%、86%、71%、86%、43%和71%。

中醫(yī)強調(diào)整體觀念和辨證論治。中醫(yī)中的“證”是診治疾病的基礎(chǔ)，是疾病某階段的高度概括。目前，中醫(yī)“證”的確定很大程度上依賴于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗，這使得“證”的可靠性和準(zhǔn)確性受到限制。近年來很多學(xué)者嘗試從生化、生理、超微結(jié)構(gòu)等方面對“證”進(jìn)行研究。但中醫(yī)學(xué)證候并不是幾個理化指標(biāo)可以代替的，我們更多的是需要了解各指標(biāo)間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系[11]。臨床中醫(yī)證型主要是靠醫(yī)生主觀判斷，很難標(biāo)準(zhǔn)量化?，F(xiàn)代中醫(yī)藥現(xiàn)代研究應(yīng)用需要對內(nèi)涵進(jìn)行研究和闡述，制定統(tǒng)一的、科學(xué)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

蛋白組學(xué)技術(shù)強調(diào)把人作為一個完整的系統(tǒng)來研究，多采用“自上而下”的研究方式，通過高通量的篩選差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，從整體上展示生物體內(nèi)在的變化狀態(tài)，避免了以往采用單一指標(biāo)或少數(shù)幾個指標(biāo)研究某種病理和生理變化[12]。蛋白質(zhì)組學(xué)傾向于受內(nèi)外因擾動后生物學(xué)事件的最終結(jié)果，因而更能夠準(zhǔn)確反映機體的狀態(tài)。中醫(yī)理論亦強調(diào)即時性和動態(tài)性。人和自然是相統(tǒng)一的，四時氣候的變化、晝夜變化對疾病也有一定的影響。而蛋白質(zhì)學(xué)描述的是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)隨時間為參數(shù)的變化，在不同的時間，蛋白質(zhì)的種類、濃度及比例是變化的。蛋白質(zhì)組學(xué)以時間為參數(shù)與中醫(yī)學(xué)的即時性和動態(tài)性是十分吻合的。

辨證分型是中醫(yī)藥治療的核心。目前對脾虛痰濕證的辨證則依然停留在依靠中醫(yī)四診資料綜合分析判斷，不可避免有主觀因素影響，尚缺乏較為公認(rèn)的客觀指標(biāo)。目前對肺癌的辨證分型尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此，在辨證論治過程中難免出現(xiàn)證候概念命名和證候辨證標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。近年，有研究從理論和現(xiàn)代技術(shù)方面，試圖探討中醫(yī)辨證分型的分子基礎(chǔ)，期望從生物信息比較分析中實現(xiàn)微觀辨證分型。晏雪生等[13]通過蛋白芯片技術(shù)證實了中醫(yī)虛實證候與肺癌患者多項腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)密切相關(guān)。郎笑梅等[14]研究證實，痰瘀證組與正常對照組之間檢測到18種差異蛋白（P＜0.05）。譚秦湘[15]應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)，通過對正常組與肝郁證組血清蛋白質(zhì)圖譜的比較，發(fā)現(xiàn)12個差異蛋白質(zhì)點，為從整體上探討肝郁證特有蛋白質(zhì)的表達(dá)，研究揭示了肝郁證候的重要相關(guān)蛋白質(zhì)特性。蛋白質(zhì)組學(xué)在肺癌發(fā)病機制、早期診斷、病理分型、鑒別診斷、預(yù)后與療效監(jiān)測研究積累了較多研究基礎(chǔ)，目前主要集中在早期診斷方面。大量的研究采用了2-DE技術(shù)來鑒別腫瘤組織與正常組織間的差異蛋白[16-21]。

臨床上中醫(yī)證型主要是靠醫(yī)生主觀判斷，影響了證候判斷的可靠性和準(zhǔn)確性。蛋白質(zhì)是機體生物功能的最終執(zhí)行分子，蛋白質(zhì)組學(xué)時代的到來，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展帶來新的契機。已有學(xué)者借助此技術(shù)對肺癌的診斷、預(yù)后、療效等做了大量研究，也在中醫(yī)臨床辨證分型及證本質(zhì)研究中取得了一定成績。本研究試圖應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)分析肺癌脾虛痰濕證與肺癌其他證型差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，闡明肺癌脾虛痰濕證“病-證”對應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，明確評價肺癌脾虛痰濕證客觀、標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)，為肺癌辨證分型提供新的認(rèn)知視角。

2 材料與方法

2.1 材料及儀器

碳酸氫鈉、硫脲、碳酸鈉、除高峰度蛋白試劑盒購自美國Sigma公司，Tris堿、尿素、二硫蘇糖醇、3-[3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸鹽、溴酚藍(lán)、甘油、十二烷基磺酸鈉、亞甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、丙烯酰胺、低熔點瓊脂糖、IPG buffer、蛋白質(zhì)純化試劑盒、固相pH值干膠條、定量試劑盒均購自瑞典Amersham Biosciences公司；丁醇、冰醋酸為德國Merck公司產(chǎn)品，無塵擦拭紙購自美國Kimberly Clark公司。DU730型核酸/蛋白分析儀（美國 Beckman）；IPGphor III等電聚焦儀，Ettan DALT six大型垂直電泳系統(tǒng)、掃描儀Typhoon9400和DeCyder V6.0分析軟件（Amersham Biosciences）；質(zhì)譜儀Ultraflex III（美國布魯克）；制冰機（意大利Scotsman）；多維軌道搖床（美國）；小型臺式離心機（德國Eppendorf）；排風(fēng)柜（美國 Fisher）。

2.2 病人的選擇

脾虛痰濕證辨證標(biāo)準(zhǔn)：

四診合參，由兩名經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的資深中醫(yī)醫(yī)師分別單獨進(jìn)行中醫(yī)辨證，根據(jù)周岱翰教授提出的肺癌脾虛痰濕型個體辨證標(biāo)準(zhǔn)及積分表，將脾虛證、痰濕證的主要癥狀及次要癥狀按照程度不同進(jìn)行評分，優(yōu)化入選條件。

臨床表現(xiàn)：咳嗽，痰多，胸悶氣短，疲倦乏力，少氣懶言，面色萎黃或蒼白，形體消瘦或肢體浮腫，食少，腹脹，大便溏。

舌脈象：舌淡胖，或舌邊有齒印，苔白或膩，脈濡或緩或滑。

本研究按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)選取3例肺癌脾虛痰濕型患者及3例正常人，患者均來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。各組取得血漿組織，速凍存于液氮中，再置于-80℃保存，備雙向電泳及質(zhì)譜分析用。

2.3 碘比色法測定脾虛患者sAA活性

2.3.1 唾液測量體積與PH值后，離心機10 000 rpm離心5 min，上清取出進(jìn)行活性測定。

2.3.2 活性測定

取唾液上清液0.1 mL置于50 mL的定容瓶，加蒸餾水定容，即得稀釋50倍的唾液標(biāo)本，采用碘比色法進(jìn)行sAA活性測定。酶活性單位定義：1mL唾液在37℃中保溫15 min，在實驗條件下水解1mg淀粉至遇碘不呈藍(lán)色為1單位（U）。

2.4 比色法測定脾虛患者尿液中D-木糖排泄率

2.4.1 樣品采集：受試者于試驗前一天晚上10時至第二天早晨試驗結(jié)束前完全禁食但可以喝水；試驗當(dāng)天清晨先排空尿液后空腹口服D-木糖5.0 g（溶于300 ml溫開水）。口服木糖后2小時內(nèi)不再進(jìn)食，收集口服D-木糖后2小時內(nèi)的全部尿液，測量尿液總量。準(zhǔn)確量記尿液總量后，留10-20 ml尿液（加3-5滴6 mol/L鹽酸防腐，4℃保存，當(dāng)天內(nèi)測定）。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

分別精確量取D-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，然后加入已配制好的飽和苯甲酸溶液的上清液稀釋至刻度，從而配成濃度分別為0.025 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1的溶液備用。分別從5個容量瓶中量取D-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，然后加入對溴苯胺試劑5 mL混勻，并置于70℃的恒溫水浴鍋中保溫10 min后再取出室溫放置70 min。以0號為空白校正光密度到零點（0號為飽和苯甲酸上清液1 mL加對溴苯胺試劑5 mL），立即使用紫外分光光度計在520 nm波長處測定吸光度值并記錄下來。將2小時所留尿液樣品用蒸餾水稀釋10倍，平行取稀釋好的樣品3份，各取1 mL，再加入對溴苯胺試劑5 mL，混勻后置于70℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，取出室溫放置70 min后，以對照管為空白調(diào)零（對照管為蒸餾水1 mL加對溴苯胺試劑5 mL），立即測定吸光度值（OD值），以標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出相應(yīng)的尿液D-木糖濃度。

2.5 雙向電泳及質(zhì)譜分析

2.5.1 組織總蛋白的抽提及蛋白質(zhì)濃度測定

血清12 000 r/min，4℃離心30 min，吸取上清入EP管，用50 mmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.5，取5 μl用于蛋白質(zhì)濃度測定，其余上清置于-70℃保存?zhèn)溆?。采?D Quant Kit蛋白質(zhì)定量試劑盒測定總蛋白濃度，其操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算直線回歸方程。

2.5.2 蛋白質(zhì)熒光染料標(biāo)記

每組蛋白質(zhì)均取25 μg等量混合作為內(nèi)標(biāo)，50 μg內(nèi)標(biāo)蛋白用400 pmol Cy2進(jìn)行標(biāo)記，分別以50 μg蛋白每400 pmol Cy3和400 pmol Cy5標(biāo)記，冰上避光放置30 min，再加1 μl亮氨酸（10 mmol/L）中止反應(yīng)10 min。

2.5.3 2D-DIGE分析膠電泳和圖像掃描

50 μgCy2，Cy3和Cy5標(biāo)記的樣品進(jìn)行混合，加等體積的2×樣品緩沖液，再加適量水化液補至總體積450 μl，上樣，30V水化13h，然后經(jīng)過100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，最后穩(wěn)定在8 000 V下進(jìn)行等電聚焦8.5 h。一向電泳完后，取出IPG膠條先后置入平衡A液和平衡B中各平衡15 min。平衡后的膠條移至濃度12.5%PAGE分離膠上端用0.5%瓊脂糖封膠，2.5 W電泳30 min，然后以11 W恒功率電泳，直至溴酚藍(lán)指示線到達(dá)凝膠底邊處停止電泳。整個過程均避光操作。雙向電泳完后，膠條取出擦洗干凈，輕置Typhoon掃描儀，以Cy3，Cy2，Cy5設(shè)置進(jìn)行掃描獲得分析使用的凝膠圖像。另外，還需制作一塊制備膠，步驟同2D-DIGE，其上樣為1 000 μg內(nèi)標(biāo)蛋白，電泳后考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，用于差異蛋白的質(zhì)譜鑒定。

2.5.4 圖像采集分析和質(zhì)譜分析

2D-DIGE分析膠圖像用DeCyder 5.0軟件進(jìn)行分析。首先對每一張膠圖上的所有蛋白質(zhì)點掃描進(jìn)行膠內(nèi)分析（differential in-gel analysis，DIA），對不同膠的同一個蛋白質(zhì)點與內(nèi)標(biāo)匹配，每個點的容積（背景刪減后）、面積、峰值均被檢測，計算每組（Cy3/Cy2，Cy5/Cy2）成像的標(biāo)準(zhǔn)豐度比值，然后對不同膠上的同一個蛋白質(zhì)點與內(nèi)標(biāo)匹配，進(jìn)行膠間分析（biological variation analysis，BVA），對匹配后每個蛋白質(zhì)點的相對量進(jìn)行比較分析后確定差異蛋白，篩選分析圖像出現(xiàn)并比率≥1.5，P≤0.05的差異點。在制備膠上找到與分析膠上的差異點匹配的質(zhì)點，取點，脫色，酶解及樣品萃取，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)進(jìn)行檢測，獲取PMF肽指紋圖譜及PKL文件，在NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)匹配。

2.5.5 MALDI-TOF-TOF分析

使用德國Bruker公司的Ultraflex III質(zhì)譜儀進(jìn)行分析：1級質(zhì)譜：反射模式，離子源加速電壓1為24 kv，加速電壓2為22kv，離子延遲提取0.000 ns，真空度1.4x10-7Torr，正離子譜測定，測定范圍控制在700-4 000，獲得樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰自動剔除；接著利用LIFT軟件將PMF強度最大的4個峰（SN＞20）進(jìn)行串級質(zhì)譜分析。所獲得圖譜使用Biotools軟件檢索，以 MASCOT（Matrix Science，London，UK）為搜索引擎。搜索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫為SwissProt；檢索種屬為human；數(shù)據(jù)檢索的方式為combined；最大允許漏切位點為1；酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置：PMF75ppm，MS/MS0.5Da.

3 結(jié)果

3.1 碘比色法測定脾虛患者sAA活性測定

由表2可發(fā)現(xiàn)脾虛患者酸刺激后sAA較酸刺激后下降，而正常人酸刺激后其sAA是升高的，符合脾虛患者sAA變化。但是酸刺激前后sAA變化并不明顯。

計算公式：AMY=（對照管吸光度-測定管吸光度）×2/10×30/7.5×100/0.1

表1 酸刺激前后OD值

表2 酸刺激前后sAA活性

3.2 比色法測定脾虛患者尿液中D-木糖排泄率

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定結(jié)果見表3。以吸光度值為Y軸、D-木糖濃度為X軸，構(gòu)建回歸曲線方程。得出線性回歸方程為：Y=1.518 2 X+0.025 2，R2=0.989 2。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果

3.2.2 根據(jù)線性回歸方程推算出尿液的D-木糖濃度見表4，再根據(jù)計算公式獲得其相應(yīng)的D-木糖排泄率見表5。計算公式如下：

尿木糖含量（mg）＝尿液D-木糖濃度×2小時尿總量（L）×稀釋倍數(shù)

尿木糖吸收率＝{尿木糖含量（mg）/5000（mg）}×100%

表5表明：患者尿D-木糖排泄率與按文獻(xiàn)報道的健康志愿者有所降低，患者腸道吸收功能顯著低下，試驗結(jié)果支持臨床脾虛證的診斷。

3.3 雙向電泳結(jié)果

通過2D-DIGE分辨來自脾虛痰濕型與非脾虛痰濕型肺癌患者血清的蛋白質(zhì)。使用DeCyder軟件分析圖像。通過DeCyder軟件分析，在所有6個樣本的蛋白質(zhì)點圖譜中，與健康人相比≥1.5；p≤0.05，有7個蛋白質(zhì)位點有顯著表達(dá)差異。

表4 尿D-木糖濃度

表5 尿D-木糖排泄率

3.4 MALDI-TOF-MS結(jié)果

從制備凝膠中切下所有差異蛋白質(zhì)位點，用胰蛋白酶原位消化并通過MS分析。MALDI-TOFMS分析和數(shù)據(jù)庫匹配確定了7個位點作為相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并且斑點具有高序列覆蓋度和質(zhì)量準(zhǔn)確度。427位點代表蛋白質(zhì)K1C10，428位點代表蛋白質(zhì)NFM，991位點代表蛋白質(zhì)HP，1130位點代表蛋白質(zhì)WDR5，1481位點代表蛋白質(zhì)APOA1，1499位斑點代表蛋白質(zhì)SMS2，1564位點代表蛋白質(zhì)SAMD14（表6）。

3.5 差異蛋白的功能分析

使用FunRich軟件分析肺癌脾虛痰濕證的7個差異分子，其分子功能主要為：結(jié)合組蛋白，結(jié)構(gòu)分子、運輸和連接酶活性（圖1）。生物學(xué)過程主要為：參與細(xì)胞生長/維持，免疫反應(yīng)，運輸，細(xì)胞通訊以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（圖2）。生物途徑中起重要作用：鞘磷脂代謝，ABCA轉(zhuǎn)運蛋白在脂質(zhì)體內(nèi)平衡，脂質(zhì)和脂蛋白的代謝，晝夜節(jié)律通路，高密度脂蛋白介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，乳糜微粒介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運（圖3）。

4 討論

明代醫(yī)家李中梓指出，“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”。中醫(yī)辨證及臨床研究證實脾虛痰濕證是肺癌的主要證型，健脾除痰方藥治療本證得較好療效。既往從生化、生理、免疫、細(xì)胞增殖與凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等來探討脾虛痰濕證應(yīng)用健脾除痰法防治肺癌的機理，辨證則依四診資料綜合分析，缺乏較為公認(rèn)的客觀指標(biāo)[22]。本研究通過碘比色法測定脾虛患者sAA活性及尿液中D-木糖排泄率測定，進(jìn)一步確認(rèn)了脾虛痰濕的證型。碘比色法發(fā)現(xiàn)脾虛患者酸刺激后sAA較酸刺激后下降，而正常人酸刺激后其sAA是升高的，符合脾虛患者sAA變化。但是酸刺激前后sAA變化并不明顯，考慮如下可能：1.試劑質(zhì)量影響檢測結(jié)果；2.測量方法需要進(jìn)一步優(yōu)化；3.腫瘤及放化療治療對SAA的影響。

表6 肺癌脾虛痰濕證的7個差異蛋白

圖1 差異蛋白的分子功能分析

圖2 差異蛋白的生物學(xué)過程分析

圖3 差異蛋白的生物學(xué)通路分析

通過對蛋白質(zhì)組的技術(shù)分析得到7個與肺癌脾虛痰濕證相關(guān)的蛋白。KRT10是I型（酸性）細(xì)胞角蛋白家族的成員。KRT10和KRTl角蛋白在分化層的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)配對表達(dá)，它們以異二聚合體形式組裝成細(xì)胞中間絲，這些絲狀體連同肌動蛋白微絲和微管共同構(gòu)成上皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架，在保護(hù)機體對于外界溫度及機械刺激的抵御方面起重要作用。目前KRT10在肺癌細(xì)胞中的作用機制研究較少。其在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制，仍需進(jìn)一步研究證實[23]。NEFM由神經(jīng)纖維細(xì)絲、最豐富的中間纖維在神經(jīng)系統(tǒng)。NEFM除了在神經(jīng)元細(xì)胞骨架中起結(jié)構(gòu)作用外，在突觸密度中還具有特殊的生物學(xué)功能。目前其與肺癌的關(guān)系尚未見報道，其具體作用機制仍需進(jìn)一步研究[24]。HP，是一種酸性糖蛋白，主要作用是結(jié)合游離的血紅素，防止鐵和血紅蛋白自腎臟流失，減少對腎臟的損傷。研究表明HP在肺癌患者血清中顯著增高。在非小細(xì)胞肺癌早期血清結(jié)合珠蛋白濃度即明顯升高，且血清結(jié)合珠蛋白濃度隨著非小細(xì)胞肺癌分期的增高而增高，因此HP可作為非小細(xì)胞肺癌的篩查、診斷及預(yù)測分期的輔助指標(biāo)。另外在晚期非小細(xì)胞肺癌療效的評估中也具有指導(dǎo)意義[25]。WDR5是WD40蛋白家族的成員之一，同時也是染色體H3修飾蛋白復(fù)合體Trithorax group（TrxG）的重要組分之一，能降低染色體的折疊，促進(jìn)染色體的開放，而促進(jìn)對應(yīng)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)WDR5與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[26]。ApoA-I屬于載脂蛋白A1/A4/E家族成員，在肝臟和小腸中合成的，這種蛋白質(zhì)的功能包括將組織中的膽固醇反向運輸?shù)礁闻K進(jìn)行排泄，轉(zhuǎn)移脂肪酸和乙醇胺返回細(xì)胞進(jìn)行再利用，作為卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的輔助因子（LCAT）將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯（CE）。有研究表明，在ApoA-I和癌癥之間。在乳腺癌中，ApoA-I數(shù)值較低與更高的癌癥風(fēng)險相關(guān)，特別是復(fù)發(fā)。ApoA-I的低水平也可視為是早期胰腺癌和卵巢癌的預(yù)測指標(biāo)[27]。鞘磷脂合酶（SGMS）是一種神經(jīng)遞質(zhì)酶調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺合成鞘磷脂（Cer）4。雖然SGMS有三個同系物，即SGMS1、SGMS2和sgms相關(guān)蛋白（SGMSr），只有SGMS1和SGMS2促進(jìn)SM合成，而SGMSr促進(jìn)SM類似物的合成神經(jīng)酰胺phosphoethanolamine5。Cer在其中起著至關(guān)重要的作用細(xì)胞凋亡的調(diào)控。之前的一項研究確定SGMS2的上調(diào)顯著降低了表達(dá)Cer，導(dǎo)致細(xì)胞異常凋亡活性，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們的發(fā)現(xiàn)表明SGMS2-mediated TGF-β/Smad的激活信號通路在乳腺癌進(jìn)展中起著重要作用[28]。SAMD14為近年來發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，位于17q21.33染色體上，其5'端上游有PDK2（pyruvate dehydrogenase kinase 2）基因，3'端下游有Neurabin-2基因。SAMD14編碼蛋白由417個氨基酸組成，參與細(xì)胞發(fā)育等多種細(xì)胞功能調(diào)控。研究表明SAMD14啟動子區(qū)有68%的CG。在小鼠肺癌樣本中，研究發(fā)現(xiàn)SAMD14啟動子區(qū)CpG島存在異常高甲基化。鼠SAMD14與人的基因同源，人肺癌樣本中亦檢測到其表達(dá)下調(diào)，該基因啟動子區(qū)域也呈現(xiàn)異常高甲基化修飾。在使用甲基化抑制劑處理A549后，SAMD14的表達(dá)恢復(fù)。該結(jié)果提示SAMD14啟動子區(qū)的高甲基化修飾與其表達(dá)的沉默有關(guān)，即其啟動子區(qū)的高甲基化至少是SAMD14表達(dá)下調(diào)的原因之一。還有報道顯示，SAMD14也可參與血液系統(tǒng)造血功能調(diào)控，它的其余功能尚不清楚[29]。

通過對差異蛋白的分子功能分析發(fā)現(xiàn)，脾虛痰濕型肺癌與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。正常情況下，免疫系統(tǒng)可以識別并清除腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞，但為了生存和生長，腫瘤細(xì)胞能夠采用不同策略，使人體的免疫系統(tǒng)受到抑制，不能正常的殺傷腫瘤細(xì)胞，從而在抗腫瘤免疫應(yīng)答的各階段得以幸存。腫瘤的這種免疫逃逸是腫瘤的獲得性特征之一，目前免疫相關(guān)的抗癌策略是一個很有前景的挑戰(zhàn)，并為成功對抗脾虛痰濕型肺癌提供了希望。

5 小結(jié)

中醫(yī)與現(xiàn)代分子生物學(xué)的結(jié)合使中醫(yī)理論更加科學(xué)、規(guī)范。蛋白質(zhì)組研究從整體水平反映疾病過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的動態(tài)演變，與中醫(yī)“整體觀念”及“辨證論治”的認(rèn)識極相似。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)分析肺癌脾虛痰濕證與肺癌其他證型差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，探索肺癌脾虛痰濕證“病-證”相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)及診斷、鑒別診斷客觀指標(biāo)。本研究證實了肺癌脾虛痰濕證與人體的免疫及代謝系統(tǒng)密切相關(guān)，為今后的研究提供了新的思路，然而本研究還有待進(jìn)一步的實驗驗證。此外，7個差異蛋白是否可以解釋脾虛痰濕證型的蛋白表達(dá)，7個差異蛋白在其他腫瘤的脾虛痰濕證中是否也有表達(dá)變化，肺癌脾虛痰濕證與肺癌非脾虛痰濕證患者的蛋白表達(dá)差異，以上的問題以及對差異蛋白質(zhì)和脾虛痰濕證型之間內(nèi)部機制尚有待深入的研究。