表沒食子兒茶素沒食子酸酯在干細胞增殖及成骨分化作用中的研究現狀

梅宏翔 張懿丹 張城浩 劉恩言 陳昊 趙志河 廖文

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)學院 成都 610041；

2.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院正畸科 成都 610041

牙周炎是常見的口腔疾病之一，能夠破壞牙齒支持組織（包括牙槽骨和牙周膜），最終導致牙齒脫落[1]。隨著干細胞成骨分化研究的深入，干細胞（尤其是骨髓間充質干細胞）療法和基于此的骨組織工程成為牙周炎骨質流失治療的新興研究方向[2-3]。

循證醫(yī)學證據顯示，茶飲用量作為一個獨立因素，與股骨、腰椎等處的骨密度呈正相關[4]。此外，綠茶能夠抑制牙周炎的發(fā)生、發(fā)展，改善其牙周袋深度以及附著喪失[5]。這提示茶葉中的某些有效成分可能在牙周炎相關骨質流失的預防與治療中發(fā)揮著重要作用。作為在茶葉中含量最多的兒茶素，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）在成骨分化中的作用受到了藥物研發(fā)者的廣泛關注。

研究顯示，EGCG在抑制牙周炎癥[6]、延緩牙槽骨吸收[7]以及引導牙周組織再生[8]中發(fā)揮了重要作用。EGCG可以直接或者通過抗炎[9]、抗氧化[10]等途徑作用于成骨分化通路，影響干細胞成骨分化，對骨重建有正向調節(jié)作用。這些研究為EGCG作為牙周炎相關骨質流失的輔助治療藥物提供了理論支撐，也為其對骨組織工程材料的改性奠定了基礎。本文就EGCG在干細胞增殖及成骨分化中的作用進行綜述，同時探討該作用在組織工程材料改性中的應用。

1 EGCG簡介

茶是世界上最受歡迎的飲品之一，茶多酚是茶葉中的主要成分，占茶葉干重的30%左右。超過80%的綠茶多酚是兒茶素（3,3,4,5,7-五羥基黃烷），即黃烷-3醇的衍生物。兒茶素主要由4種單體組成，分別是EGCG、表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate，ECG]、表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]。其中，含量最多、藥理作用最強的組分是EGCG[11]。EGCG含有8個羥基，是綠茶多酚中含羥基最多的化合物（圖1）。

圖 1 EGCG的結構Fig 1 The structure of EGCG

EGCG多羥基結構（尤其是B環(huán)上的鄰二羥基和C環(huán)上的沒食子?；┵x予了其強大的自由基清除活性[12]。這也為EGCG的抗氧化[10]、抗腫瘤[13]以及促進牙周組織缺損修復[8]等藥理作用奠定了基礎。

2 EGCG對干細胞增殖的影響

研究者對于EGCG在干細胞增殖中的作用意見不一。多數研究[14-15]發(fā)現，濃度為2.5、5、10 μmol·L-1的EGCG均能夠促進骨髓間充質干細胞的增殖，其中5 μmol·L-1的EGCG對增殖的促進作用最強。5、10、20 μmol·L-1的EGCG甚至能夠阻斷缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）對骨髓間充質干細胞活性的抑制作用[10]。即使對于脂肪干細胞，1.25和10 μmol·L-1的EGCG對其增殖活性的促進作用也較為顯著[16]。但有研究[17]也提出，1 μmol·L-1的EGCG就能抑制小鼠間充質干細胞D1細胞系增殖。這種差異可能是實驗使用的細胞來源和組成不同導致：前者使用從人骨髓組織中提取出的間充質干細胞；后者使用的細胞系則是由小鼠骨髓基質前體細胞克隆而來，雖具有多項分化潛能，但其主要成分仍為成骨細胞。

EGCG對細胞增殖的影響可能與多酚羥基結構有關。其獨特的氧化還原微環(huán)境可以賦予其抗氧化或促氧化的雙重能力[18]。研究[10,19-20]發(fā)現，10 μmol·L-1以下的EGCG可以增加細胞內的抗氧化酶，防止活性氧粒子（reactive oxygen species，ROS）介導的染色體損傷，抑制可能損害細胞功能的誘導性氧化應激；高濃度（＞50 μmol·L-1）的EGCG則會自動氧化，在培養(yǎng)基中產生過氧化氫，具有細胞毒性作用。因此，不同濃度的EGCG可能是通過調節(jié)ROS水平而影響細胞生長、增殖。

因此，適宜劑量（1～10 μmol·L-1）的EGCG能通過抗氧化途徑促進干細胞生長、增殖，具有良好的生物安全性。這為牙槽骨吸和骨質疏松相關藥物研發(fā)以及骨缺損重建提供了重要參考。

3 EGCG對干細胞成骨分化的影響

動物實驗指出，EGCG能預防骨質疏松及促進骨重建[21]，并抑制牙周炎所導致的骨吸收[22]。這可能是EGCG通過抑制過度的氧化應激[23]以及炎癥反應[22]而抑制破骨細胞形成，而對于EGCG是否能夠直接刺激干細胞成骨分化尚未統(tǒng)一認識。

成骨細胞成熟包括3個主要的發(fā)育階段：增殖、細胞外基質的沉積與礦化[24]。細胞外基質與細胞成骨相關基因的表達密切相關。研究發(fā)現，EGCG對于骨髓間充質干細胞成骨分化具有積極作用。Chen等[25]比較了茶葉中不同兒茶素對于D1細胞系成骨分化的影響，發(fā)現EGCG的促進作用最強。其他的研究[17,26]也證實，在EGCG的刺激下，干細胞的堿性磷酸酶（alkaline phospha tase，ALP）以及骨基質蛋白如Ⅰ型膠原、骨保護素、骨鈣素等成骨分化標志性蛋白質出現了進行性上調。在轉錄水平也表現出相同的趨勢。轉錄因子Runx2和osterix在骨標志性蛋白質形成早期起著至關重要的正向作用[27]，而晚期Runx2的過表達則會抑制成骨細胞成熟[28]。EGCG則能使Runx2早期上調而隨后下調[29]，并促進osterix的表達[17]，有利于成骨分化以及骨結節(jié)的生成。

然而，EGCG對小鼠成骨細胞前體細胞MC3T3-E1成骨分化的影響引起了一些爭議，Kamon等[30]認為EGCG以劑量依賴性的方式抑制MC3T3-E1細胞系成骨分化；而Sakai等[31]則發(fā)現EGCG增強了前列腺素-2α介導的骨保護素合成，從而促進成骨分化。但MC3T3-E1的多項分化潛能較弱，并不能藉此否定EGCG對干細胞成骨分化的正向作用。

4 EGCG促進干細胞成骨分化的機制

4.1 抗氧化應激途徑

研究[32]表明，過量的氧化應激能夠促進成骨細胞和骨細胞的凋亡，使骨形成速率減慢。已知ROS能夠通過Wnt、Foxo、Hedgehog等信號通路抑制骨髓間充質干細胞的成骨分化[33]。EGCG的多酚羥基結構賦予其強大的抗氧化功能，多酚羥基結構能夠與過量的自由基如ROS結合，使其失去活性，從而終止自由基聚合反應[34]。因此，EGCG具有較強的抗氧化功能，能夠阻斷ROS的抑制作用，促進干細胞成骨分化。

4.2 抗炎途徑

由于炎癥能夠促進骨質吸收和抑制新骨形成，牙周炎成為牙槽骨骨質流失的重要原因。EGCG的另一種作用就是抗炎，可能在抑制炎癥性骨質流失中扮演著重要角色。有研究[9]證實，EGCG能抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠炎癥性牙槽骨骨吸收。這可能與EGCG與層粘連蛋白受體（laminin receptor，LR）特異性結合而介導抗炎作用有關[35]。EGCG的處理能夠通過LR依賴的途徑下調Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4的表達并且上調其負調控因子Tollip，來抑制TLR4/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路的表達[36]。另一項研究[15]進一步證實，EGCG能夠通過阻斷NF-κB通路來抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的生成，從而促進骨髓間充質干細胞成骨分化。

4.3 經典的成骨分化通路

Wnt/β-連環(huán)蛋白（catenin）通路參與了骨量調節(jié)，能夠控制全身所有骨骼的骨質發(fā)育以及防止成年后的骨質流失[37]。Wang等[38]發(fā)現，EGCG通過直接上調Wnt/β-連環(huán)蛋白通路元件的表達，促進骨髓間充質干細胞的成骨分化活性。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/Smad信號通路可能在EGCG的調節(jié)作用中也扮演著重要角色。Jin等[14]研究發(fā)現，單獨使用EGCG對于骨髓間充質干細胞成骨分化的促進作用有限，僅能使BMP-2表達升高，并不能使其他成骨相關基因表達上升。Chen等[17]證實，EGCG能夠促進核心結合因子α1（core-binding factor-α1，Cbfa1）的表達。而Cbfa1又能與細胞質BMP信號分子Smad結合，在誘導干細胞成骨分化中發(fā)揮關鍵作用[39]。這些研究說明EGCG促進成骨分化的能力可能與BMP/Smad相關通路存在潛在聯系。

4.4 表觀遺傳途徑

微小RNA（micro RNA，miRNA）在成骨分化以及骨折愈合中具有重要作用。研究[40]證實miRNA-210能夠通過調節(jié)血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與缺氧調節(jié)的成骨分化。骨髓間充質干細胞經EGCG處理后，其mi-RNA210水平升高，從而促進成骨分化相關信號分子的表達。這可能依賴于miRNA-210對受體酪氨酸激酶配體-A3的3’非翻譯區(qū)的靶向抑制作用[41]。

5 EGCG修飾的組織工程材料的應用

鑒于良好的生物安全性以及對成骨分化的促進作用，EGCG局部作用在骨折以及牙槽骨骨質流失的修復中可能有廣闊的應用前景。因此，EGCG對骨組織工程材料的改性受到較高的關注。

目前，材料荷載被認為是藥物局部低濃度持續(xù)釋放的重要方式。有研究表明，EGCG/凝膠復合物能促進小鼠顱骨缺損修復。這可能與EGCG在體內緩慢釋放并在凝膠崩解后繼續(xù)附著于細胞表面有關，從而使EGCG能持續(xù)抑制炎癥，促進小鼠間充質干細胞成骨分化[42]。

另一方面，EGCG與骨組織工程材料在誘導成骨方面存在著協同作用。Rodriguez等[43]將不同量的EGCG與α-磷酸三鈣顆粒交聯后填充于小鼠顱骨缺損中。結果顯示，加載了0.1和0.2 mg EGCG的植入物能促進不規(guī)則骨小梁以及由成骨細胞構成的骨樣群落的形成。這表明骨髓間充質干細胞成骨分化能力得到了進一步增強。

此外，Chu等[44-46]就EGCG對于膠原膜的修飾作用進行了系列研究，發(fā)現EGCG交聯后不僅能夠增強材料的促成骨能力，還能改善支架材料的物理性能、表面形態(tài)和機械性能，促進骨髓間充質干細胞增殖和黏附，降低炎性因子的釋放。這表明EGCG可以作為引導性骨再生材料的常規(guī)交聯劑，以發(fā)揮多重作用，促進骨缺損的修復。

這些研究都為EGCG應用于引導性骨再生提供了應用場景和理論依據。但是，由于高濃度的EGCG可以抑制細胞體外增殖及成骨分化[47]，并抑制小鼠體內的骨形成[43]，故不同臨床應用方式下的最佳荷載濃度仍需要進一步的研究。

6 展望

EGCG作為茶葉的重要活性成分，已經受到了研究人員、醫(yī)藥廠商和公眾的廣泛關注。飲茶量與牙周炎癥呈負相關的流行病學證據提示，EGCG在預防和治療牙周炎癥中具有巨大的潛力。然而，盡管許多實驗都對于EGCG在抗牙周病原菌以及抗炎中的積極作用進行了肯定，但是其在牙槽骨再生的作用及其具體機制仍待進一步探索。

在基礎研究方面，在考慮口腔應用環(huán)境復雜性的同時，還應進一步深入至干細胞成骨分化通路水平，逐步完善機制網絡。同時，目前仍欠缺先進的成像技術對于動物實驗提供系統(tǒng)性評價，以探究出最適濃度。而在未來的人體試驗中，也應該注意濃度對于安全性和治療效果的影響，并結合臨床評價方法，以確定EGCG對骨質流失以及骨質缺損等的治療效果。

就臨床應用而言，EGCG的局部應用以及對于骨組織工程材料的改性可能對于局部骨質缺損有著更加重要的意義。一方面，材料能夠局部緩釋EGCG，以避免高濃度EGCG的毒性作用；另一方面，EGCG交聯可以優(yōu)化材料性能，并可能通過抗炎、抗氧化等多種途徑協同促進成骨分化。在之后的臨床實踐中，應該根據不同的臨床場景設計不同的研究方向，對于EGCG的應用量、交聯方式、比例等進行探究，以滿足各種臨床需求。

鑒于EGCG良好的生物安全性和多重生理作用，其將為牙周炎相關骨質流失以及骨質缺損等疾病的治療提供新思路和新途徑。