HPLC法測定注射用青霉素鈉含量的不確定度分析

齊亞輝 朱 寶

（1.陜西省動物衛(wèi)生與屠宰管理站，陜西西安 710016；2.陜西省動物疫病預(yù)防控制中心，陜西西安 710016）

1 試驗部分

1.1 儀器與試藥

島津2010AHT型高效液相色譜儀，可變紫外檢測器，（日本島津公司）；Nexpower1000純水超純水器（德國HUMEN公司）；AUW220D電子分析天平（日本島津公司）。

青霉素對照品（批號：130437-201707，94.1%，中國食品藥品檢定研究院）；注射用青霉素鈉（批號：E8E180805，規(guī)格：0.96g（160萬單位），河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司）；水為超純水（自制）；乙腈為色譜純（Merck KgaA 64271 Darmstadt，Germany）；其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相A-流動相B（70：30）

流動相A：0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.5）-甲醇—水（10：30：60）；

流動相B：0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.5）-甲醇—水（10：50：40）；

流速：1.0ml/min；檢測波長：225nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。

1.3 測量方法

供試品溶液的制備：取裝量差異下的內(nèi)容物，混勻，精密稱取0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液的制備：精密稱取青霉素對照品10mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

分取上述供試品溶液及對照品溶液20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算，其結(jié)果乘以1.0658，即為供試品中（C16H17N2NaO4S）的含量，測得結(jié)果按平均裝量計算為96.2%。

2 不確定度的評定

2.1 數(shù)學(xué)模型

式中 Q-按平均裝量計算注射用青霉素鈉標(biāo)示百分含量（%）；AX－供試品的峰面積；mR－對照品的稱樣量（mg）；VX－供試品的稀釋體積（ml）；P-對照品的純度（%）；供試品的平均裝量（g）；AR-對照品的峰面積；mX－供試品的稱樣量（g）；VR－對照品的稀釋體積（ml）；0.96－供試品的規(guī)格（g）；1.0658－轉(zhuǎn)換因子；1000－由g轉(zhuǎn)化為mg的換算系數(shù)。

2.2 不確定度的主要來源分析

（1）稱量帶來的不確定度，包括天平的最大允許誤差、稱量重復(fù)性。

（2）樣品稀釋帶來的不確定度，包括：容量瓶的最大允許誤差，體積測量的重復(fù)性，溫度與體積校準(zhǔn)時的溫度差異。

（3）峰面積帶來的不確定度，包括：峰面積的重復(fù)性，儀器等。

（4）對照品的純度帶來的不確定度。

（5）供試品的平均裝量帶來的不確定度，包括：裝量差異，天平的重復(fù)性。

2.3 不確定度分量計算

2.3.1 供試品稱樣量的相對不確定度urel（mX）

（1）電子天平在d=0.1mg檔，檢定證書給出天平示值誤差為0.3mg。按矩形分布，乘以轉(zhuǎn)換因子b=0.6，u1（mX）=0.3mg×0.6=0.18mg

（2）電子天平在d=0.1mg檔，檢定證書給出天平重復(fù)性為0.3mg。按矩形分布，乘以轉(zhuǎn)換因子b=0.6，u2（mX）

2.3.2 對照品稱樣量的相對不確定度urel（mR）

（1）電子天平在d=0.01mg檔，檢定證書給出天平示值誤差為0.03 mg，按矩形分布，乘以轉(zhuǎn)換因子b=0.6，u1（mR）=0.03mg×0.6=0.018mg

（2）電子天平在d=0.01mg檔，檢定證書給出天平重復(fù)性為0.04mg，按矩形分布，乘以轉(zhuǎn)換因子=0.04mg×0.6=0.024mg

2.3.3 供試品平均裝量的相對不確定度urel（）

取本品5瓶，分別精稱內(nèi)容物為：0.9678，0.9691，0.9760，0.9606，0.9558平均裝量，按貝賽爾公式計算，

則urel（）=0.0035/0.9659=0.0036

2.3.4 供試品稀釋體積的相對不確定度urel（VX）

（1）100ml 容量瓶為A級，最大允許誤差為±0.10ml，按矩形分布，乘以轉(zhuǎn)換因子b=0.6，u1（VX）=0.10 ml ×0.6=0.06 ml

（2）對100ml容量瓶重復(fù)測量10次，用貝塞爾公式計算得其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.021ml。則u2（VX）= 0.021ml

（3）本次試驗溫度為26℃，校準(zhǔn)溫度為20℃，按矩形分布，則u3（VX）= 100×6×2.1×10-4×0.6＝0.076ml。

2.3.5 對照品稀釋體積的相對不確定度urel（VR） 同urel（VX）的評定

（1）10ml容量瓶（A級）的最大允許誤差為±0.020ml，則u1（VR）=0.020 ml ×0.6=0.012 ml。

（2）讀數(shù)的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.015ml u2（VR）= 0.015ml

（3）溫度 u3（VR）= 10×6×2.1×10-4×0.6＝0.0076ml。

2.3.6 供試品峰面積的相對不確定度urel（AX）

（1）兩份樣品平行進(jìn)樣兩次，峰面積為6745947，6743720，6857776，6851480平均值分別為6744834，6854628采用極差法評定，R分別為2227、6296查表n=2時，得極差系數(shù)C=1.13，則s（AX）分別為1971、5572，則=4179A，u1rel（AX）=4179/6799731=0.00061。

（2）儀器檢定證書給出的定量測量重復(fù)性為0.33%，按矩形分布，u2rel（AX）= 0.33%×0.6=0.0020。

2.3.7 對照品峰面積的相對不確定度urel（AR） 同urel（AX）的評定

兩份對照品平行進(jìn)樣兩次，峰面積為6760629，6766781，6579044，6570302，則u1（AR）=6989A，u1rel（AR）=6989/6669439=0.0010。

2.3.8 對照品的純度的相對不確定度urel（P）

對照品的純度為94.1%，未給出限度表示，其帶來的不確定度在此可忽略不計。

2.3.9 供試品的規(guī)格0.96和轉(zhuǎn)換因子1.0658均是給定數(shù)值，其帶來的不確定度在此可忽略不計。

2.4 不確定度分量（見表2）

表2 各種不確定度分量匯總

2.5 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度計算

根據(jù)表2相對不確定分量合成后求得：

擴(kuò)展不確定度的計算：取包含因子k =2，按平均裝量計算，U=2×0.60%=1.2%

注射用青霉素鈉含量測定結(jié)果：按平均裝量計算，Q=（96.2±1.2）%（k=2）

3 討論

（1）從本文可以看到，實驗中樣品的平均裝量帶入的不確定度是最大的，其次是對照品的稱量。在工作中應(yīng)隨機(jī)取樣，充分混勻樣品等來減少取樣過程所帶來的不確定度分量。還可適當(dāng)加大對照品的稱量來減少由此帶來的不確定度。

（2）玻璃量器帶來的不確定度分量中，10ml容量瓶的不確定度大于100ml容量瓶，在含量測定中盡可能選用體積較大的玻璃量器。