小窩蛋白-1重組慢病毒載體的構建及鑒定

董雷 馬春芳 蔡宛如

小窩蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）是細胞膜上膜內陷型胞膜囊泡-小窩的結構和功能性標志蛋白，在細胞信號轉導、膽固醇轉運、細胞內吞等方面發(fā)揮重要作用[1]。Cav-1廣泛存在于肺泡Ⅰ型上皮細胞膜上。近年研究發(fā)現(xiàn)Cav-1在急性肺損傷肺水腫發(fā)病始動機制中起重要作用，與肺泡上皮細胞通透性、鈉水轉運有關[2]。本課題組前期研究結果也表明Cav-1在小鼠急性肺損傷時的表達水平明顯高于正常小鼠[3]，這提示Cav-1在急性肺損傷發(fā)病中起重要作用。本研究試圖構建Cav-1重組慢病毒，并驗證其在293T細胞中的表達，以期為構建Cav-1高表達的急性肺損傷動物模型提供實驗材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質粒 293T細胞購于上海ATCC細胞庫，大腸桿菌DH5α、GV287慢病毒載體購自上海吉凱基因公司。

1.1.2 實驗動物 清潔級雄性C57BL6小鼠24只購于上海斯萊克公司。

1.2 主要試劑和儀器 1kp DNA ladder Marker（批號：#SM0311）購于加拿大Fermentas公司，250bp DNA ladder Marker（批號：DL250+，100T）購于上海捷瑞公司，瓊脂糖（批號：GA4-100）購于上海賽百盛基因技術有限公司，Taq酶、dNTP、內切酶等購于大連TAKARA公司，In-FusionTMPCR Cloning Kit（批號：63962）購于美國Clontech公司，質粒抽提試劑盒（批號：A1460）購于美國Promega公司，F(xiàn)BS、DMEM細胞培養(yǎng)試劑購于美國Gibco公司，invitrogen lipofectamine 2000轉染試劑購于美國 invitrogen公司，Cav-1（D46G3）X 兔單抗和 β-actin抗體購于美國CST公司。PCR儀（型號：2720 thermal cycler）購于美國Applied Biosystems公司，穩(wěn)壓DNA電泳儀購于美國Bio-Rad公司，凝膠成像儀購于上海天能科技有限公司，細菌搖床（型號：HI-9211K）購于華利達實驗設備公司。

1.3 方法

1.3.1 Cav-1重組慢病毒質粒的構建和檢驗 慢病毒載體GV287原件順序為Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位點為BamHI/BamHI。根據(jù)目的基因Cav-1（NM_007616）設計 PCR 引物，上游引物：5′-GGAGGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGTCTGGGGGCAAATACGTAG-3′，下游引物：5′-TCACCATGGTGGCGGGATCTATCTCTTTCTGCGTGCTGATGC-3′。該引物已含交換配對堿基、酶切位點，并含有目的基因5′端部分序列用于PCR釣取目的基因。采用PCR法獲取Cav-1基因。慢病毒質粒經酶切后瓊脂糖電泳回收，PCR產物Cav-1基因交換入線性GV287慢病毒質粒，克隆成Cav-1重組慢病毒質粒。經過PCR鑒定，鑒定引物為Globin-F 上游引物：5′-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3′，pEGFP-N-3 下游引物：5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3′，篩選出陽性克隆。用氯化鈣制備新鮮大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，對陽性克隆進行測序鑒定。

1.3.2 Cav-1重組慢病毒的包裝 將處于對數(shù)生長期的293T細胞接種于24孔板中，每孔細胞數(shù)約為2×104/ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞融合度達到約80%。按照invitrogen lipofectamine 2000轉染試劑使用說明轉染293T細胞，轉染6h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基。1.3.3 Cav-1重組慢病毒的功能測定 轉染293T細胞24h后，觀察質粒上熒光標記基因的表達情況，若熒光率＞80%，拍完熒光后補加500μl正常培養(yǎng)基，待長滿后收集細胞用于RNA提取或蛋白質檢測。

1.3.4 293T細胞中Cav-1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法收集轉染后24h的293T細胞，在冰浴條件下用細胞裂解液裂解細胞，13 000r/min低溫離心，收集上清液煮沸備用。取20μg上樣量用10%SDS-PAGE電泳分離，400mA 1.5h轉至PVDF膜，用5%BSA封閉2h，Cav-1（1∶1 000）4℃孵育過夜，次日 TBST 洗滌后，用標記二抗（1∶1 000）孵育 2h 后顯影。

1.3.5 Cav-1重組慢病毒質粒的收集、濃縮及滴度測定收集富含病毒的細胞上清液，密度梯度離心和超濾去除絕大部分細胞蛋白，濃縮后得到高濃度重組慢病毒，分裝保存于-80℃。取少量采用實時定量PCR法測定病毒滴度，用質粒作為標準品設立標準曲線，待測樣品與標準曲線比較后，得到Cav-1重組慢病毒的滴度。

1.3.6 Cav-1重組慢病毒質粒轉染小鼠 將24只C57BL6 小鼠分為陰性對照組、1×108pfu/鼠組、5×108pfu/鼠組和10×108pfu/鼠組4組，每組6只。所有小鼠均采用乙醚麻醉，固定頭部使鼻腔垂直向上。陰性對照組用1×108pfu/鼠濃度的Cav-1空載體病毒經鼻腔滴注至肺內，對肺組織中的支氣管平滑肌細胞、肺泡上皮細胞和血管內皮細胞進行轉染；1×108pfu/鼠組、5×108pfu/鼠組和 10×108pfu/鼠組分別采用 1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3個梯度的重組慢病毒Cav-1經鼻腔滴注至肺內進行轉染，3d后采用免疫組化法檢測肺組織中Cav-1的表達情況。

2 結果

2.1 目的載體酶切結果以及目的基因獲取 慢病毒載體經BamHI酶切電泳后，為6kb左右的載體片段（圖1）。目的基因 Cav-1（NM_007616）經 PCR擴增后獲得580bp的片段（圖2）。

圖1 目的載體酶切電泳圖（1：10kb Marker；2：載體酶切電泳；3：未酶切載體電泳）

圖2 目的基因Cav-1 PCR產物電泳圖（1：Marker；2：Cav-1 產物）

2.2 Cav-1重組慢病毒構建及PCR擴增鑒定測序 PCR產物交換入線性化表達載體，PCR鑒定的陽性轉化子為805bp（圖3），經過測序鑒定，序列正確。

圖 3 PCR 擴增鑒定結果（1：Marker；2~6：陽性轉化子）

2.3 Cav-1重組慢病毒轉染293T細胞及鑒定 Cav-1重組慢病毒轉染293T細胞后進行熒光檢測，細胞內可觀察到明顯的熒光（圖4），說明目的質粒轉染正常、目的質粒熒光標記基因表達正常。Western blot法檢測293T細胞Cav-1蛋白表達，目的基因融合蛋白大小為48kd，結果可見48kd附近有特征條帶，與目的基因融合蛋白相吻合（圖5）。

圖4 Cav-1重組慢病毒轉染293T細胞的熒光檢測（a：明場；b：暗場；熒光顯微鏡下，×200）

圖 5 Western blot法檢測 Cav-1蛋白表達（M：蛋白 Marker；1：SURVIVIN-3FLAG-GFP陽性對照；2：未轉染293T細胞樣品；3：Cav-1重組慢病毒轉染293T后樣品）

2.4 Cav-1重組慢病毒滴度測定 實時定量PCR法檢測重組慢病毒滴度，結果得出Cav-1重組慢病毒滴度為1.3×1012copies/ml。

2.5 Cav-1重組慢病毒在動物體內的驗證 Cav-1重組慢病毒轉染3d后，免疫熒光顯示，小鼠肺組織結構正常，Cav-1在平滑肌細胞、肺泡上皮細胞和血管內皮細胞呈現(xiàn)表達，其中陰性對照組Cav-1表達稍微弱，隨著Cav-1重組慢病毒在小鼠體內的濃度升高，其肺組織中Cav-1 表達也逐漸增高，其中 5×108pfu/鼠組、10×108pfu/鼠組轉染后肺組織Cav-1表達水平均明顯高于1×108pfu/鼠組和陰性對照組（圖6）。

圖6 慢病毒轉染小鼠體內肺組織中Cav-1的表達情況（a：陰性對照組；b：1×108pfu/鼠組；c：5×108pfu/鼠組；d：10×108pfu/鼠組；免疫組化法，×400）

3 討論

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)病過程極其復雜，其機制尚未完全明了，但目前認為肺泡上皮屏障的破壞是其重要的發(fā)病機制之一，即肺泡上皮細胞的彌漫性損害，肺泡表面活性物質減少，基底膜通透性增加，導致肺臟實質細胞損傷和肺間質水腫[2]。Cav-1是肺泡上皮細胞膜上小窩的主要結構蛋白，處于細胞各路信息平臺的中心位置，使得各路信號通路之間相互影響成為可能[4]。當肺泡上皮細胞受到外界有害物質（如脂多糖）侵襲后，首先激活的是位于細胞膜小窩內的磷脂酶A2（PLA2），水解肺泡上皮細胞膜磷脂，造成膜結構和功能破壞，導致滲透性肺水腫；其次PLA2啟動炎癥介質生成，促進炎癥介質聚集和活化，并作用于其他細胞如肺泡巨噬細胞、肺血管內皮細胞、中性粒細胞等效應細胞，釋放各類炎癥介質如TNF-α、IL-6等[5-6]。這些炎癥介質又可激活小窩內各類絡氨酸膜類受體及下游分子、G蛋白偶聯(lián)受體及下游分子、非受體類絡氨酸激酶等。這其中Cav-1通過其“腳手架”結構域與各信號通路起到了調節(jié)信號傳導互通的功能。因此Cav-1在急性肺損傷炎癥反應中起重要作用。

本實驗成功構建Cav-1重組慢病毒，為進一步建立過表達Cav-1的肺泡上皮細胞株及動物小鼠C57BL6的肺損傷模型，研究Cav-1在急性肺損傷中肺泡Ⅰ型上皮細胞炎癥反應中的作用以及與各信號通路之間的作用和關系提供了實驗依據(jù)。